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第一部分高糖和高浓度胰岛素对树突状细胞免疫成熟的影响目的：糖尿病是动脉粥样硬化(AS)发生的重要危险因素,但其引起AS机制尚不明确。树突状细胞(Dendritic cell, DCs)是目前发现的功能最强的专职性抗原提呈细胞(APC),近年来研究发现DCs参与了AS的免疫炎症反应的过程。本部分探讨不同浓度葡萄糖和胰岛素对人单核源的树突状细胞(monocyte derived dendritic cells, MoDCs)分化成熟、免疫功能的影响。方法：采用免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,在含重组人粒-单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF,100ng/ml)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4,50ng/ml)的完全培养基中培养五天使其分化为未成熟DCs,在细胞培养的第六天,一组细胞分别加入终浓度为5.5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖和30mmol/L甘露醇；另一组细胞分别加入终浓度为lnmol/L、10nmol/L、100nmol/L浓度的胰岛素,干预24h后采用流式细胞术检测DCs表型(CD83、CD86、 HLA-DR);FITC标记的Dextran检测DCs吞噬功能；ELISA法检测细胞培养上清液中白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素-12(IL-12)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的浓度。结果：与正常浓度葡萄糖(5.5mol/L)组相比,高浓度葡萄糖(15mol/L、30mmon/L)干预呈浓度依赖性上调DCs表面共刺激分子CD86和成熟度标志HLA-DR、CD83的表达,且分泌细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α水平明显升高,也呈浓度依赖性,IL-10的水平则较正常浓度葡萄糖明显下降；与正常葡萄糖组相比,高浓度葡萄糖明显降低了DCs的吞噬功能。与浓度1nmol/L胰岛素干预组相比,10nmol/L、100nmol/L浓度的胰岛素干预呈浓度依赖性上调了CD86、 CD83、HLA-DR表面分子的表达,细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α水平呈浓度依赖性升高,IL-10的水平则明显下降；与1nmol/L胰岛素组相比,1000nmol/L胰岛素明显降低了DCs的吞噬功能。结论：高糖和高浓度胰岛素是胰岛素抵抗的重要组分,高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素,这可能是DCs参与糖尿病动脉粥样硬化炎症免疫反应发生的重要机制之一。第二部分高糖和高浓度胰岛素对树突状细胞清道夫受体表达的影响目的：清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1在DCs摄取抗原及免疫功能成熟过程中起了重要作用,本部分探讨不同浓度葡萄糖和胰岛素对DCs清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1表达及DCs摄取氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的影响,并进一步观察SR-A、CD36、LOX-1在DCs摄取oxLDL过程中的作用。方法：采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养液培养5天,使其分化为未成熟DCs。一组细胞分别加入终浓度为5.5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖,另一组细胞分别加入终浓度为1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L浓度的胰岛素,干预24h后,收集细胞。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot方法检测DCs清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1的表达。同时,用不同浓度葡萄糖和胰岛素干预DCs24小时后,加入或不加入SR-A、CD36. LOX-1阻断抗体,将DCs与Dil标记的oxLDL共同孵育3小时,采用激光共聚集方法观测DCs吞噬oxLDL’情况,并用流式细胞术进行定量分析。结果：与5.5mol/L葡萄糖组相比,在mRNA和蛋白水平,15mol/L、30mmon/L均可明显上调DCs表面清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1的表达(p<0.05),与5.5mmol/L葡萄糖干预组相比,30mmol/L葡萄糖明显促进DCs吞噬oxLDL的能力(p<0.05),该作用可被SR-A、CD36抗体阻断,但LOX-1没有此种作用。另外,与浓度1nmol/L胰岛素干预组相比,10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L浓度的胰岛素显著上调了SR-A、CD36、LOX-1的表达(p<0.05),并且呈浓度依赖性,100nmol/L胰岛素较1nmol/L胰岛素明显促进DCs吞噬oxLDL的能力(p<0.05),同样该作用可被SR-A、CD36抗体阻断,但LOX-1没有此种作用。结论：高糖和高浓度胰岛素明显上调DCs表面清道夫受体SR-A、CD36、 LOX-1的表达；并且高糖和高浓度胰岛素促进DCs摄取oxLDL,这一过程主要通过SR-A和CD36完成的。高糖和高浓度胰岛素对DCs清道夫受体表达的影响可能是糖尿病促进动脉粥样硬化发生发展的一个重要机制。第三部分高糖和高浓度胰岛素对树突状细胞清道夫受体表达影响的机制研究目的：探讨高糖和高浓度胰岛素对DCs表面清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1表达影响的作用机制。方法：采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14’单核细胞,经含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养液培养5天,使其分化为未成熟DCs。为研究葡萄糖对DCs清道夫受体表达影响,将细胞分为下列五组①5.5mmol/L葡萄糖、②30mmol/L葡萄糖、③30mmol/L葡萄糖+SB203580(p38MAPK阻断剂)、④30mmol/L葡萄糖+NAC(ROS阻断剂)、⑤30mmol/L葡萄糖+BAY11-7082(NF-κB阻断剂),采用Real-time PCR法和Western-blot法分别检测DCs清道夫受体SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表达；同时在前四组中,采用Western blot法检测核蛋白中NF-κB p65的表达情况。为研究胰岛素对DCs清道夫受体表达的影响,将细胞分为下列四组①1noml/L胰岛素、②100nmol/L胰岛素、③100mmol/L胰岛素+LY294002(PI3K抑制剂)④100mmol/L胰岛素+PD98059(MAPK抑制剂),采用Real-time PCR法和Western-blot法分别检测DCs清道夫受体SR-A、CD36和LOX-1的nRNA和蛋白的表达。结果：与5.5mmol/L葡萄糖组相比,30mmol/L葡萄糖明显促进DCs清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表达,SB203580、NAC、BAY11-7082预处理可明显抑制SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表达；同时,30mmol/L葡萄糖干预较5.5mmol/L葡萄糖明显促进NF-κB p65的表达,SB203580、NAC可明显抑制其表达。另外,与1noml/L胰岛素组相比,100nmol/L胰岛素明显促进DCs清道夫受体SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表达,PD98059可明显抑制100nmol/L胰岛素对DCs清道夫受体表达的促进作用,但LY294002干预后DCs清道夫受体表达的影响未受明显抑制。结论：高糖通过促进DCs内ROS的生成并激活p38MAPK,进一步促进NF-κB的表达,并最终上调DCs清道夫受体的表达；高浓度胰岛素对DCs清道夫受体表达的促进作用主要是通过MAPK信号通路起作用,PI3K信号通路在其中并不起主要作用。本研究结果进一步证实了DCs在动脉粥样硬化的发生发展中的重要作用。