研究背景多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是常见的内分泌及代谢紊乱性疾病,发病率占生育年龄女性5%-10%。PCOS病因尚不清楚,临床表现异质性,可以表现为月经异常、排卵障碍、临床高雄等,同时可合并肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常等代谢异常,是发生2型糖尿病、子宫内膜癌等疾病的高危因素。该疾病是生殖医学领域研究的热点和难点。排卵障碍是PCOS患者不孕的主要原因,诱导排卵是PCOS合并不孕患者的一线治疗。但是对于接受了标准促排卵治疗后仍未妊娠,以及同时合并输卵管因素或者男性因素不孕的患者,需要借助体外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization&embryo transfer, IVF-ET)及卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技术获得妊娠。IVF/ICSI技术为PCOS不孕患者提供了有效的治疗手段,控制性卵巢超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)是辅助生殖技术的关键过程。但是,由于PCOS患者对于卵巢刺激的敏感性增加,与非PCOS患者相比,接受COH治疗的PCOS患者每周期的获卵率及未成熟卵率显著增加,但是受精率显著降低。在临床工作中,我们发现部分PCOS患者虽然获卵数多,但是卵子及胚胎质量差,影响患者治疗结局。优化促排卵方案,保证窦卵泡对卵泡刺激激素(follicular stimulating hormone, FSH)的适宜反应,获取高质量卵子,是获得良好妊娠结局的前提。迄今为止,尚没有一个指标可以同时预测卵巢对促排卵的反应性以及卵子发育潜能。2011年有学者创造性地提出了卵泡输出率(follicular output rate, FORT)的概念,对月经周期规律患者的研究认为,FORT是反应卵巢中卵泡潜能的量化指标,但是FORT对PCOS患者IVF/ICSI结局的预测价值尚不明确。卵冠丘复合物(cumulus-oocyte complex, COCs)中,卵丘颗粒细胞直接包绕着卵母细胞,伴随着卵母细胞发育、成熟、排卵至受精的过程。卵丘颗粒细胞分解代谢胆固醇、葡萄糖,通过缝隙连接为卵母细胞提供必要的能量,对卵母细胞的发育是至关重要的。近年来的研究提示卵丘颗粒细胞基因表达的差异可以作为预测卵子及胚胎发育潜能的非侵入性方法。脂联素(Adiponectin)作为一种脂肪细胞因子,对于调节人胰岛素敏感性起到非常重要的作用。PCOS患者血清脂联素水平下降,而脂联素水平与胰岛素抵抗程度呈负相关,PCOS患者脂联素水平下降可能是导致其卵巢功能异常的重要原因。前期对山东汉族PCOS患者的研究显示,脂联素基因SNP rs1501299+276(A/C)与SNP rs2241766+45G15G(G/T)多态性与PCOS发病具有相关性,其中脂联素基因SNP+276(A/C)多态性具有调节PCOS患者胰岛素敏感性的作用,在PCOS的发病过程中提供了发生胰岛素抵抗的遗传易感性。近年来的研究认为脂联素直接参与调节生殖功能,体外培养小鼠卵冠丘复合物经脂联素作用后,可以显著增加受精率、胚胎卵裂率及囊胚形成率；人卵丘细胞中AdipoR1、AdipoR2的表达量与体外培养胚胎的囊胚形成率相关,提示卵丘细胞可能是脂联素作用的一个重要靶点,对胚胎的发育潜能具有一定的作用。但是,脂联素及其受体在PCOS患者卵丘颗粒细胞中的表达情况以及与PCOS患者胚胎发育潜能的相关性尚未见研究报道。基于以上研究背景,本课题从提高PCOS患者胚胎发育潜能,改善妊娠结局着手,进行了相关临床及基础研究。第一部分通过分析IVF/ICSI周期促排卵方案及妊娠结局等临床资料,评估卵泡输出率在评价PCOS患者卵巢对FSH反应性、卵子质量及预测IVF/ICSI妊娠结局方面的价值。第二部分通过检测脂联素及其受体在不同质量胚胎所对应的卵丘颗粒细胞中的表达情况,分析脂联素及其受体与胚胎发育潜能的相关性,明确脂联素是否通过卵丘颗粒细胞发挥影响PCOS患者胚胎发育潜能的作用。第一部分多囊卵巢综合征患者卵泡输出率预测IVF/ICSI结局的研究目的研究体外受精-胚胎移植/卵胞浆内单精子显微注射周期中,卵泡输出率在评估多囊卵巢综合征患者卵巢对FSH反应性及预测妊娠结局的价值。方法以2010年1月至2011年12月在烟台毓璜顶医院生殖医学中心进行IVF/ICSI治疗的1643个周期作为研究对象。其中多囊卵巢综合征患者140例,非多囊卵巢综合征患者1503例。按照2003年ESHRE/ASRM建议的诊断标准作为PCOS患者的纳入标准。PCOS组与非PCOS组患者的中位年龄均为32岁。PCOS患者中,79例(56.43%)患者为稀发排卵和／或无排卵+高雄激素+卵巢多囊样改变；46例(32.86%)患者为稀发排卵和／或无排卵+高雄激素；11例(7.86%)为稀发排卵和／或无排卵+卵巢多囊样改变；4例(2.86%)为高雄激素+卵巢多囊样改变。所有患者均采用标准长方案进行控制性超促排卵(COH),开始应用促性腺激素(Gn)日通过阴道B超检测,记录双侧卵巢中直径3-10mm窦卵泡数(AFC),注射hCG日记录双侧卵巢中直径16-22mm成熟卵泡数(PFC),计算出卵泡输出率(FORT=PFC/AFC)。注射hCG后34-36h行阴道超声引导下穿刺取卵术,取卵当日根据男方精液情况行常规IVF或ICSI受精,IVF或ICSI后16-18小时观察受精情况,取卵后第3天进行胚胎移植,剩余可移植胚胎冷冻保存。自取卵日开始进行黄体支持,胚胎移植后14天查血hCG确定生化妊娠,移植后35天阴道B超检查探及妊娠囊确定为临床妊娠。结果在PCOS患者的140个治疗周期中,临床妊娠66周期,未妊娠74周期,临床妊娠率为47.14%(66/140)。妊娠组FORT值显著低于未妊娠组(0.56±0.21vs.0.66±0.29,P<0.05)。FORT的均数为0.65,根据FORT值,将PCOS患者分为三组,低FORT组(FORT<0.5, n=45),中等FORT组(FORT0.5～0.73, n=56)及高FORT组(FORT>0.73, n=39)。根据FORT分组后,胚胎种植率及临床妊娠率在低、中、高FORT三组间无统计学差异。随着FORT逐渐增高,成熟卵泡数及获卵数逐渐增加,然而值得注意的是,尽管在高FORT组,获卵数是最多的(12.04±7.54vs.15.63±7.08vs.17.21±7.66,P<0.05),但是2PN受精率(63.47%vs.69.49%vs.60.66%,P<0.01)以及优质胚胎率(68.06%vs.72.71%vs.64.99%,P<0.05)在中等FORT组最高,提示中等FORT值组的患者可以获得较好的IVF/ICSI结局。非-PCOS患者的1503个治疗周期中,临床妊娠788周期,未妊娠715周期,临床妊娠率为52.43%(788/1503),PCOS患者与非PCOS患者临床妊娠率无统计学差异(P>0.05)。妊娠组与未妊娠组相比,两组间FORT (0.66±0.25vs.0.63±0.26,P>0.05)无统计学差异。妊娠组的2PN受精率(69.20%vs.64.79%,P<0.001)、优质胚胎率(75.77%vs.55.90%,P<0.001)显著高于未妊娠组。根据FORT值,将非-PCOS患者分为三组,低FORT组(FORT<0.5,n=402),中等FORT组(FORT0.5～0.73,n=632)及高FORT组(FORT>0.73,n=469)。 FSH/LH比值(1.73±1.87vs.1.52±0.82vs.1.49±0.82,P=0.007)以及AFC(14.51±6.33vs.14.00±5.37vs.12.32±4.28,P<0.001)在低FORT组最高。从低FORT组至高FORT组,PFC(5.49士2.85vs.8,41±3.27vs.11.54士4.33,P<0.001),获卵数(8.45±5.64vs.11.52±6.37vs.13.30±6.34,P<0.001),可移植胚胎总数(4.94±3.22vs.6.37±3.69vs.7.33±3.89,P<0.001)逐渐增高。与此同时,优质胚胎率(65.98%vs.66.48%vs.68.91%,P<0.05)、胚胎种植率(29.68%vs.33.80%vs.35.06%,P<0.01)、临床妊娠率(46.27%vs.53.46%vs.55.65%,P<0.05)随着FORT的增高也是逐渐增高的,差异具有统计学意义,而2PN受精率(68.07%vs.66.95%vs.67.13%,P>0.05)在三组之间无统计学差异。回归分析显示FORT与AFC(r=-0.162,P<0.001),血清基础卵泡刺激激素(r=-0.123,P<0.001)呈负相关,与PFC(r=0.607,P<0.001),可移植胚胎总数(r=0.259,P<0.001),以及优质胚胎总数呈正相关(r=0.197,P<0.001)。以优质胚胎数作为自变量,进行多元线性回归分析,结果显示在所有因变量中,FORT(t=1.982,P<0.05)以及获卵数(t=17.246,P<0.01)是主要影响变量,而不是AFC或者PFC。结论中等FORT值的PCOS患者以及高FORT值的非PCOS患者可以获得较好的IVF/ICSI妊娠结局。PCOS患者进行超促排卵治疗时,应调整用药尽量得到适宜的卵泡输出率,从而改善IVF/ICSI妊娠结局。第二部分脂联素及其受体与多囊卵巢综合征患者胚胎发育潜能的相关性研究目的检测脂联素及其受体基因在不同质量胚胎所对应的卵丘颗粒细胞中的表达情况,分析脂联素及其受体与胚胎发育潜能的相关性,明确脂联素是否通过卵丘颗粒细胞发挥影响PCOS患者胚胎发育潜能的作用。方法PCOS组共27例,按照2003年ESHRE/ASRM建议的诊断标准作为PCOS患者的纳入标准。对照组为因输卵管因素接受IVF-ET治疗的患者,共28例。所有患者根据体重指数分为体重正常组(BMI<25kg/m2)及肥胖组(BMI≥25kg/m2)。行阴道超声引导下穿刺取卵术后获取卵冠丘复合物,用机械法分离每个卵子的卵丘颗粒细胞,采用单卵微滴短时授精,卵子与收集的卵丘颗粒细胞一一对应,根据每个卵子受精、胚胎发育及囊胚形成情况,回顾性将卵子所对应的卵丘颗粒细胞分为囊胚形成组(B+组)和未形成囊胚组(B-组)。采用real time RT-PCR和western blot的方法检测脂联素及其受体mRNA、蛋白表达情况,并比较B+组和B-组的mRNA表达量是否存在差异。结果Real time RT-PCR和western blot方法检测到AdipoQ. AdipoR1、AdipoR2和T-cadherin基因mRNA及蛋白在卵丘颗粒细胞中有表达,但是以AdipoRl和AdipoR2的表达为主。体重正常PCOS患者中,AdipoR2基因mRNA的相对表达量在囊胚形成组(PB+组)所对应卵丘颗粒细胞中显著高于未形成囊胚组(PB-组)(0.1647±0.0161vs.0.0783±0.0385,P<0.05)；在肥胖PCOS患者中,AdipoRl及AdipoR2基因mRNA的相对表达量在囊胚形成组(PB+组)所对应卵丘颗粒细胞中均显著高于未形成囊胚组(PB-组)(0.5162±0.0371vs.0.2448±0.0333,P<0.01)(0.1948±0.0307vs.0.1057±0.0236,P<0.05)。在非-PCOS患者中,脂联素及其受体基因mRNA的相对表达量在不同质量胚胎组间无显著性差异。结论脂联素、AdipoR1、AdipoR2和T-cadherin基因mRNA和蛋白在卵丘颗粒细胞中有表达,但是以AdipoRl和AdipoR2的表达为主。AdipoR2基因的mRNA表达水平与PCOS患者胚胎发育潜能具有相关性；AdipoR1基因的mRNA表达水平与肥胖PCOS患者的胚胎发育潜能相关。脂联素可能通过上调PCOS患者卵丘颗粒细胞AdipoR1和AdipoR2的表达而发挥影响胚胎发育潜能的作用。