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病毒、酒精、肝毒性药物等因素所致的慢性肝损害,均会产生肝纤维化,进而发展为肝硬化,目前尚无有效的根治办法。我国罹患慢性肝损害的人数众多,寻找有效的抗肝纤维化方法,阻止肝硬化的进展,是亟待解决的问题。结缔组织生长因子（CTGF）作为促肝纤维化的主要细胞因子,在肝纤维化的机制中发挥重要作用。CTGF主要通过介导转化生长因子-β（TGF-β）活化肝星状细胞（HSC）,导致细胞外基质（ECM）过度积聚,从而导致肝纤维化。HSC活化是肝纤维化发生、发展的中心环节,CTGF在HSC中的高表达是HSC活化不可或缺的条件,因此,抑制CTGF在HSC中的表达,就有可能阻止HSC的激活,进而阻止肝纤维化的进程。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是生物体内一种序列特异性转录后基因沉默（PTGS）,慢病毒载体是常用的介导RNAi的病毒载体之一,既可感染分裂期细胞又可以感染非分裂期细胞,不易诱发宿主免疫反应,能高效地感染靶细胞,表达的持续时间较长,是基因沉默的有效工具。本研究选择HSC为靶细胞,以CTGF为切入点,应用慢病毒载体介导的RNAi技术,沉默CTGF基因功能,探讨其在HSC活化中的作用,为肝纤维化的防治及其发病机制研究提供有益的支持。1、包含目的基因的RNAi慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定根据GenBank收录的大鼠CTGF（NM022266）基因序列设计了4条siRNA及1条阴性对照序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,克隆转化后提取质粒,PCR鉴定及DNA序列测定证实所插入的片段序列与合成序列完全一致,表明已成功构建了5个包含目的基因（1个为阴性对照基因）的慢病毒载体转移质粒。2、RNAi慢病毒载体的包装及筛选将构建成功的转移质粒与两种辅助包装元件载体质粒共转染293T细胞,包装成4个表达CTGFsiRNA及1个阴性对照siRNA的慢病毒载体。继而将5个重组体分别感染HSC-T6,应用RT-PCR和Western Blot筛选出1个抑制效率最高的重组体,命名为Len/siRNA-CTGF,作为随后实验应用的工具载体,其瞬时感染的抑制效率达84.6%。3、慢病毒载体介导的CTGF基因沉默效应及其对下游基因表达的影响HSC-T6作为活化的肝星状细胞系,以高水平表达I型胶原（COL I）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）和TIMP-2为特点。通过了解HSC-T6在CTGF基因沉默前后COL I、TIMP-1和TIMP-2的mRNA的变化,来分析CTGF对HSC活化的影响。将Len/siRNA-CTGF及阴性对照病毒分别感染HSC-T6细胞,96h后采用RT-PCR的方法验证Len/siRNA-CTGF对HSC-T6中CTGF的抑制效果,并检测Len/siRNA-CTGF对TIMP-1、TIMP-2及COL I等表达的影响。结果发现Len/siRNA-CTGF可以显著抑制肝星状细胞系HSC-T6细胞中CTGF基因的表达,抑制效率达到70%左右;且CTGF被抑制的同时,TIMP-1、TIMP-2及COL I的表达量分别下降到阴性对照组的23%、18%和50%。4、CTGF基因沉默与HSC增殖、活化的关系碘化丙啶（PI）染色流式细胞仪DNA含量分析法（PI/FCM）分析HSC-T6 DNA含量、MTT法观察细胞生长曲线,发现在CTGF基因沉默后HSC-T6的增殖及生长均受到抑制。结论:成功构建并筛选出了介导CTGF基因沉默的慢病毒载体,证实慢病毒载体介导的RNAi在沉默CTGF基因后抑制HSC-T6中TIMP-1、TIMP-2及COL I等基因的表达,而HSC- T6的增殖和生长也受到了抑制,因此可能有助于抗肝纤维化的发生。