炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD),是一种慢性非特异性的肠道炎性疾病,发病机制较为复杂,其中由固有免疫和适应性免疫组成的肠黏膜免疫应答异常是IBD发生发展的关键因素。肠道树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是最重要的固有免疫细胞,通过活化、迁移,发挥强大的抗原递呈功能,从而激活适应性免疫,打破肠道稳态,导致IBD发病。首先,DCs迅速活化,其表面的活化标志物如CD80和CD86水平升高。多项临床研究表明,IBD患者肠道炎症部位聚集着大量活化的DCs。其次,在活化过程中,DCs在趋化因子受体2(chemokine receptor 2,CCR2)、CCR5和CCR7等的作用下可迁移至炎症部位甚至派氏结或肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)。最终,携带抗原信息的DCs通过外源性表达主要组织相容性复合体Ⅱ(Major histocompatibility complex classⅡ,MHCⅡ)发挥抗原递呈功能,诱导na?ve T细胞激活,使其分化成为相应的效应T辅助(T helper,Th)细胞,进而大量增殖并建立初级免疫应答,介导适应性免疫反应。新近发现,肿瘤坏死因子样配体1A(Tumor necrosis factor-like ligand 1aberrance,TL1A)作为固有免疫和适应性免疫的连接桥梁,参与IBD发病。既往研究多集中于TL1A对适应性免疫的影响,而对固有免疫的调控作用鲜有报道。有研究表明,髓系细胞高表达TL1A的转基因小鼠可发生自发性肠炎。然而有关TL1A如何调控DCs活化、迁移及抗原递呈功能及其机制均未见报道。目前已知,核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)在调节DCs的活化与免疫功能方面发挥重要作用。一项研究表明,血管内皮生长抑制因子(Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)可上调骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)NF-κB p50(65)和p-IκBα水平。而作为VEGI的同源异构体,TL1A对未成熟BMDCs的NF-κB p50(100)却无影响,故有必要深入探讨TL1A对DCs活化的调控作用及机制。因此,本研究采用髓系细胞高表达TL1A(FMS-TL1A-GFP-transgenic,M-Tg)转基因小鼠和具有相同遗传背景的野生型(Wild type,WT)小鼠,建立葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的慢性实验性结肠炎模型,同时分离小鼠BMDCs,从体内、外两方面,研究TL1A对DCs活化、迁移和刺激T细胞增殖、活化能力的影响,并探讨NF-κB信号通路在调控DCs活化中作用,以期为揭示IBD发病机制和临床靶向免疫治疗提供新靶点。具体实验分为以下三部分:第一部分髓系细胞高表达TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠结肠炎症的影响目的:探讨TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠结肠炎症以及对T细胞活化的影响。方法:1.采用髓系细胞高表达TL1A的转基因小鼠和具有相同遗传背景的野生型小鼠构建DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型。2.结肠炎症评估:通过小鼠体重变化、疾病活动指数(Daily activity index,DAI)、结肠长度、结肠病理组织学改变和结肠髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性。3.T细胞活化情况:检测肠道CD4~+T细胞的活化标志物CD44和CD69表达情况;检测血清、MLN和肠黏膜固有层单个核细胞(Lamina propria mononuclear cells,LPMC)培养上清液中γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)和白介素-17A(Interleukin-17A,IL-17A)水平;检测结肠MLN和LPMC中CD4~+IFN-γ~+细胞和CD4~+IL-17A~+细胞比率。4.检测结肠组织TL1A和DR3表达情况。结果:1.造模后,与WT组小鼠相比,Tg组小鼠体重下降更明显,DAI上升,结肠大体评分、病理评分及MPO活性均显著升高(P<0.05),结肠长度无明显差异(P>0.05)。2.T细胞活化情况:与WT组相比,Tg组MLN和LPMC中CD4~+CD44~+细胞和CD4~+CD69~+细胞比率均升高(P<0.05);与WT组相比,Tg组血清、MLN和LPMC培养液上清中IFN-γ和IL-17A水平均升高(P<0.05)。3.结肠组织TL1A和DR3表达:与WT组相比,Tg组小鼠结肠组织TL1A和DR3 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05)。结论:1.采用髓系细胞高表达TL1A的转基因小鼠和具有相同遗传背景的野生型小鼠成功构建了DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型。2.髓系细胞高表达TL1A上调肠道T细胞活化标志物CD44和CD69表达。3.髓系细胞高表达TL1A促进肠道Th1和Th17分化,上调炎症因子IFN-γ和IL-17A水平,进而加重结肠炎症。第二部分髓系细胞高表达TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠肠道树突状细胞活化的影响目的:探讨TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠肠道树突状细胞的活化及迁移的调节作用和机制。方法:1.采用髓系细胞高表达TL1A的转基因小鼠和具有相同遗传背景的野生型小鼠构建DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型。2.DCs活化和迁移情况:检测肠道DCs数量以及活化标志物CD80和CD86表达情况。3.DCs炎症因子分泌:检测血清、结肠MLN和LPMC培养上清液中IL-1β、TNF-α和IL-12/23 p40水平。4.NF-κB信号通路检测:检测结肠组织磷酸化NF-κB p65、IκBα和磷酸化IκBα蛋白表达。5.趋化因子受体表达:检测结肠组织CCR2、CCR5、CCR7和CX3CR1表达情况。结果:1.DCs分布及活化情况:与WT组相比,Tg组小鼠MLN和LPMC中MHCⅡ~+CD11c~+CD11b~+细胞比率较WT组小鼠均显著升高(P<0.05),且结肠TL1A~+CD11c~+细胞平均光密度值增高(P<0.05);Tg组MLN和LPMC中CD80和CD86表达均升高(P<0.05)。2.DCs炎症因子分泌:与WT组相比,Tg组血清、MLN和LPMC培养液上清中IL-1β、TNF-α和IL-12/23 p40水平升高(P<0.05)。3.NF-κB信号通路检测:与WT组小鼠相比,Tg组小鼠结肠组织p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达量升高(P<0.05),而IκBα蛋白表达量下降(P<0.05)。4.趋化因子受体表达:与WT组小鼠相比,Tg组小鼠结肠组织CCR2、CCR5、CCR7和CX3CR1 mRNA表达水平升高(P<0.05)。Tg组CCR5、CCR7和CX3CR1蛋白表达量较WT组显著升高(P<0.05);而CCR2蛋白表达量升高,但无统计学差异(P>0.05)。结论:1.髓系细胞高表达TL1A可增加慢性实验性结肠炎小鼠肠道树突状细胞的数量。2.髓系细胞高表达TL1A可上调慢性实验性结肠炎小鼠肠道树突状细胞活化标志物CD80和CD86的表达,并促进其分泌炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-12/23 p40;同时活化NF-κB信号通路,促进肠道树突状细胞的活化,从而加重DSS诱导的慢性实验性结肠炎。3.髓系细胞高表达TL1A可增加肠系膜淋巴结DCs的数量,上调趋化因子受体CCR2、CCR5、CCR7和CX3CR1表达,促进DCs迁移,加重结肠炎症。第三部分髓系细胞高表达TL1A对小鼠骨髓来源的树突状细胞功能的调节作用目的:探讨TL1A对小鼠骨髓来源的树突状细胞功能的调节作用。方法:1.分离Tg小鼠和WT小鼠骨髓来源的树突状细胞,应用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激活化,检测TL1A和DR3表达量。2.FITC-dextran吞噬实验检测BMDC的吞噬功能;分离脾脏Na?ve CD4~+T,通过混合淋巴细胞样反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)检测BMDCs对CD4~+T细胞活化和增殖的影响。3.检测细胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-12/23 p40水平。4.NF-κB信号通路检测:检测磷酸化NF-κB p65、IκBα和磷酸化IκBα蛋白表达。5.趋化因子受体表达:检测CCR2、CCR5、CCR7和CX3CR1表达情况。结果:1.成功分离出骨髓细胞来源的树突状细胞,与WT组相比,Tg组小鼠BMDC中TL1A和DR3 mRNA和蛋白表达量均升高(P<0.05)。2.DCs功能检测:与WT组相比,Tg组BMDCs吞噬率显著升高;BMDCs与T细胞共培养后,Tg组T细胞增殖更显著(P<0.05),且CD44和CD69表达量更高(P<0.05)。3.细胞上清液中IL-1β、TNF-α和IL-12/23 p40水平:与WT组相比,Tg组BMDCs培养液上清中上述炎症因子水平均显著升高(P<0.05)。4.NF-κB信号通路表达:与WT组相比,Tg组p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达量升高(P<0.05),而IκBα蛋白表达量下降(P<0.05)。5.趋化因子受体表达:与WT组相比,Tg组CCR2、CCR5和CCR7均显著升高(P<0.05),而CX3C1R表达无统计学差异(P>0.05)。结论:1.TL1A可增强BMDC的吞噬功能,并促进其刺激CD4~+T细胞的增殖和活化。2.TL1A可上调BMDC分泌炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-12/23 p40水平。3.TL1A可能通过活化NF-κB信号通路,上调趋化因子受体的表达参与调控DCs的活化和迁移。