本研究以山羊为材料,对影响山羊ES 细胞、EG 细胞分离与克隆的影响因素进行了探讨。为进一步建立山羊ES、EG 细胞系奠定了基础。实验主要结果如下: 1. 收集妊娠20~55d 山羊胎儿50 例,使用DMEM(高糖)+ 15% NBS(或FBS) +10 ng/mL+ 0.1 mmol/mL?-巯基乙醇+ 2 mmol/mL 谷氨酰胺+ 0.01 mmol/mL 非必需氨基酸+ 100 IU/mL青霉素+ 100 IU/ml链霉素培养液从生殖嵴(腺)中分离克隆山羊EG细胞,43 例出现EG 样细胞集落,最高一例传至6 代。胎龄为30～36 d山羊胎儿最适合山羊EG 细胞分离与克隆,胎龄大于42d,很难得到山羊EG 细胞。从新生关中奶山羊睾丸中分离培养出山羊睾丸支持细胞。对比分离得到的PGCs在饲养层GSCs、MEF、GEF 上的生长效果,发现GSCs>MEF>GEF。在基础培养液中添加10%(1000IU/ml)LIF更有利于山羊EG 的克隆。2. 用全胚法从192 枚关山羊胚胎中分离得到82 枚增殖ICM,接种在MEF 或GEF饲养层上,使用DMEM(高糖)+ 15% FBS + 0.1 mM?-巯基乙醇+ 0.01 mM 非必需氨基酸+ 10 ng/ml LIF + 100 IU/mL 青霉素+ 100 IU/ml 链霉素培养液,用中浓度消化液(0.125% Trypsin+0.02% EDTA)消化效果好,有一枚胚胎传至第8 代。3. MEF、GEF 在山羊胚胎贴壁率无显著差异(P>0.05);MEF 和GEF 饲养层均能促进山羊ES 细胞体外增殖。随着胚龄的增加,胚胎的贴壁率和ICM 的增殖率增加。孵化囊胚的贴壁率和增殖率最高,达90%和60%,与桑椹胚相比,差异均显著(P<0.05);添加LIF(10 ng/ml)有利于山羊ES 细胞(P<0.05)的分离与克隆。4. 山羊ES 细胞对胰酶不是很敏感, 0.125% Trypsin+0.02% EDTA 是较好的ES 细胞消化液,对细胞综合损伤力小,且传代后ES 细胞集落形成能力也较高。6. 分离得到的山羊ES 细胞、EG 细胞,经形态学观察、AKP 染色、SSEA、OCT4染色、体外分化实验等,证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。