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目的:苗勒氏管发育异常(Müllerian Ducts Anomalies,MDA)是一类罕见的先天性女性生殖道缺失或严重畸形的疾病,主要是由于在胚胎时期因各种原因,将来发育成为子宫、宫颈、输卵管和阴道上部的苗勒氏管单侧或双侧发育停滞、发育不良、融合不全或吸收异常,从而导致了一系列女性生殖器官缺失或畸形,如先天性无子宫无阴道(Mayer-Rokitansky-KüsterHauser syndrome,MRKH综合征)、双子宫双宫颈、单角子宫、纵隔子宫、阴道纵隔、阴道闭锁等。苗勒氏管发育异常可导致患者闭经、性生活困难、不良妊娠结局等,极度影响了患者的身心健康。迄今为止先天性苗勒氏管发育异常的发病原因尚不完全明确,多数学者认为是多基因多因素联合作用所致。目前已发现若干候选基因与苗勒氏管发育异常有关。候选基因之一TBX6基因,属于T-box基因家族,对胚胎发育和器官形成的正常调控起着重要作用。本研究旨在通过筛查中国河北地区汉族女性苗勒氏管发育异常是否存在TBX6基因的突变来探讨两者的相关性。方法:1临床资料收集:病例组:2013年3月至2014年11月期间,于河北医科大学第二医院就诊或随访的,经妇科检查及辅助检查中B超、宫腔镜、腹腔镜或子宫输卵管造影术至少两项后,由两名妇科主任医师诊断明确的97例苗勒氏管发育异常患者,对照组为110例同时期因输卵管妊娠入院手术治疗但排除生殖系统发育异常的女性,至少有一次正常妊娠,无其他任何基础疾病及各种系统发育畸形,无生殖系统发育异常家族史。病例组及对照组成员均来自中国河北省地区且分布相似,均为汉族,其核型均正常(46,XX),第二性征均发育正常,均排除性腺发育异常及先天性肾上腺皮质增生症。病例组包括MRKH综合征患者32例、始基子宫合并无阴道患者3例、双子宫双宫颈合并完全性阴道纵隔患者1例、双子宫双/单宫颈不合并阴道纵隔患者4例、纵隔子宫(完全或不完全)伴阴道纵隔患者12例,纵隔子宫(完全或不完全)不伴阴道纵隔患者11例,双角子宫患者4例,单角子宫合并/不合并残角子宫患者16例,弓形子宫患者2例,阴道斜隔综合征(表现为双子宫双宫颈,阴道斜隔完全或不完全地闭锁一侧阴道,斜隔同侧的肾脏缺如,oblique vaginal septum syndrome,OVSS)患者6例,阴道上段闭锁合并/不合并宫颈发育不良伴有功能内膜子宫患者4例,阴道横隔患者2例。获知情同意后抽取病例组及对照组成员的外周静脉血编号冻存。2提取全基因组DNA、扩增及测序:提取病例组及对照组外周静脉血中全基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对TBX6基因的9个外显子及外显子-内含子边界分别进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳与DNA Marker比对确定为目的片段后进行纯化,采用Sanger测序法进行DNA序列检测。3测序结果分析统计:以美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中正常TBX6基因序列为标准,应用Mutation Surveyor软件进行序列分析比对,应用软件SPSS 13.0进行统计分析,对检测到的错义突变应用电脑软件SIFT(Sorting Intolerant from Tolerant)及Poly Phen2(Polymorphism Phenotyping v2)进行突变位点功能预测。计量资料以中位数表示,频数资料比较采用卡方检验,P<0.05认为有统计学意义。结果:1病例组与对照组成员的来源地区分布无统计学差异(P=0.755,P>0.05)。2统计临床病例资料显示,病例组的苗勒氏管发育异常合并其他系统畸形患者共24例(24/97,24.74%),其中合并两个及以上系统畸形的患者为6例(6/97,6.19%)。病例组中所出现的合并畸形包括先天性脊柱侧弯5例(5/97,5.15%),先天性脊柱椎体发育不良1例(1/97,1.03%),脊柱裂1例(1/97,1.03%),先天性肋骨发育异常4例(4/97,4.12%),先天性四肢畸形/多指(趾)/少指(趾)3例(3/97,3.09%),单肾缺如12例(12/97,12.37%),肾异位2例(2/97,2.06%),先天性膀胱颈狭窄1例(1/97,1.03%),先天性心脏病2例(2/97,2.06%),先天性肛门闭锁1例(1/97,1.03%),先天性梅克尔憩室1例(1/97,1.03%),先天性腹股沟斜疝2例(2/97,2.06%)。在合并的所有畸形类型中骨骼系统畸形占40.00%(14/35),泌尿系统畸形占42.86%(15/35),心脏畸形占5.71%(2/35),消化系统畸形占5.71%(2/35),其他畸形占5.71%(2/35)。3病例组及对照组中均于TBX6基因第4外显子发现突变c.484G>A,为单核苷酸多态性数据库(database of Single Nucleotide Polymorphisms,db SNP)中已知的SNP(rs56098093)。3.1突变基因型(GA+AA)的频率病例组(9/97,9.3%)高于对照组(3/110,2.7%),有统计学意义(P=0.044,P<0.05)。该多态位点的最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)病例组(10/194,5.2%)高于对照组(3/220,1.4%),有统计学差异(P=0.027,P<0.05)。3.2 c.484G>A是错义突变,导致氨基酸序列第162位的甘氨酸(Gly)被丝氨酸(Ser)替代,即p.Gly162Ser,点突变对蛋白功能影响预测软件SIFT预测分数为0,Poly Phen2预测分数为1。3.3病例组中杂合突变(基因型为GA)患者为8例,包括4例MRKH综合征、1例始基子宫无阴道、1例单角子宫合并残角子宫、1例纵隔子宫合并阴道纵隔,1例阴道斜隔综合征,除此之外,在病例组中发现1例MRKH综合征患者为纯合突变(基因型AA),但对照组中未发现纯合突变。3.4该位点于MRKH综合征患者的突变率(5/32,15.6%)与其他类型MDA患者的突变率(4/65,6.2%)无统计学差异(P=0.151,P>0.05)。3.5病例组所有突变患者中有4例合并其他系统发育异常,合并其他系统畸形的MDA患者的突变率(4/24,16.7%)与未合并其他系统畸形的MDA患者的突变率(5/73,6.8%)无统计学差异(P=0.219,P>0.05)。4病例组及对照组中均于TBX6基因第9外显子发现突变c.1227G>A,为db SNP中已知的SNP(rs2289292),突变基因型(GA+AA)频率病例组(61/97,66.5%)与对照组(71/110,64.5%)无明显统计学差异(P=0.804,P>0.05);其MAF病例组(71/194,36.6%)与对照组(87/220,39.5%)无明显统计学差异(P=0.538,P>0.05);此为同义突变,不引起氨基酸改变(p.Pro409=)。5在对照组中进行两个检测到的多态位点rs56098093及rs2289292的基因型频率进行Hardy-Weinberg平衡检验,P值分别为0.99、0.89,符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。结论:1本研究中病例组及对照组成员的来源地区分布相似,对照组成员来自遗传稳定的群体,因此本研究中两组进行基因比较具有参考意义。2中国河北地区汉族女性苗勒氏管发育异常表现多样,可合并多种其他系统畸形,其中以骨骼系统畸形及泌尿系统畸形多见。3位于TBX6基因4号外显子中的SNP位点rs56098093极可能影响基因表达及蛋白功能,是有害突变。该多态性位点可能与中国河北地区汉族女性的苗勒氏管发育异常有关,但与MDA是否为MRKH综合征或其他类型无关,与是否合并其他系统畸形无关。4位于TBX6基因9号外显子中的SNP位点rs2289292可能与中国河北地区汉族女性的苗勒氏管发育异常无关。