哺乳动物精子离开睾丸后还需要经过附睾成熟的过程才能获得使卵子受精的能力。越来越多研究表明,精子与附睾微环境中蛋白质的相互作用过程对于精子最终成熟是必不可少的,然而目前仍不清楚精子细胞内蛋白质及其翻译后修饰在附睾成熟中的动态变化及参与的功能。近年来,质谱、样品制备以及鉴定软件等方法的革新带动了蛋白质组学和一系列翻译后修饰蛋白质组学的快速发展,使样品蛋白质及其翻译后修饰组的高通量检测与定量分析变成了可能。本研究通过采集大鼠睾丸、附睾头部与附睾尾部的精子构建附睾中精子成熟模型,并采用HLB-MAX-IMAC串联富集策略依次从TMT标签标记的酶解多肽中富集多肽、糖肽与磷酸化多肽。通过联合使用Proteome Discoverer（PD）与Struc GP等蛋白质组学分析软件,在大鼠精子中共鉴定到1648个蛋白质,包括1482个蛋白、305个磷酸化蛋白及172个N-连接糖蛋白,这些蛋白共同组成了大鼠精子附睾成熟过程的多维亚蛋白质组数据集。通过定量分析三种亚蛋白质组在大鼠睾丸、附睾头、附睾尾部精子中的动态变化,筛选出了三个时间点中三种亚蛋白质组的9组特异高表达的蛋白,即时间点（Time Point,TP）特异性蛋白。GO分析表明,这9组TP-特异性蛋白主要参与（a）在睾丸发生的转录;（b）在附睾头部发生的精子鞭毛组装;（c）在附睾尾部同时发生的ATP合成与消耗;（d）在附睾尾部由膜蛋白参与的受精等生物过程。这些结果表明蛋白质与磷酸化蛋白质参与了许多相似的生物学过程。进一步通过蛋白互作等分析发现,蛋白与磷酸化蛋白之间存在紧密协作,在睾丸与附睾尾部共同协作参与精子m RNA转录与能量供应等生物学过程,糖基化蛋白独特的表达方式使它没有参与这些生物学事件。进一步分析转录因子及其靶基因所表达的蛋白的丰度,发现转录因子在精子离开睾丸后失活,但精子仍然可以在附睾成熟的不同阶段调控这些蛋白的丰度,这些蛋白与能量供应、蛋白翻译以及脂类运输相关。经过蛋白与磷酸化蛋白的协同作用,精子在附睾尾具备了鞭毛运动的潜力。相较于磷酸化,糖基化通常采用“慢合成,长作用”的策略参与到生命活动中。借助Mfuzz对糖蛋白的整体变化趋势进行分析,还原了糖蛋白及糖链在附睾成熟阶段的变化,其中持续上调的糖蛋白参与了受精与黏附等生物学过程。进一步分析发现受精相关蛋白BSG的269位点上糖链在附睾成熟过程中逐步由高甘露糖型转变为末端为唾液酸且带有核心岩藻糖修饰的复杂型糖链,而葡萄糖转运相关的蛋白上高甘露糖型糖链的丰度逐步升高。经过漫长的糖蛋白成熟过程,精子细胞膜表面与受精相关糖蛋白上糖链结构最终在附睾尾部成熟,获得了使卵细胞受精的潜力。综上所述,通过对大鼠睾丸和附睾三个成熟阶段中三种不同的亚蛋白质组进行动态分析和功能预测,揭示了附睾不同成熟阶段精子内发生的生物学过程,以及亚蛋白质组之间通过互相协作以及接力等方式参与这些生物学事件,最终使精子在附睾尾部获得运动与受精能力。该研究从多维亚蛋白组学角度诠释了大鼠精子在附睾中的成熟机制,对了解雄性生殖基础生物学及男性生殖疾病等具有重要意义。