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microRNA(miRNA)为一类单链短非编码RNA,其长度约为20-25 nt,主要通过与靶mRNA的3’端非编码区相结合从而抑制靶基因的表达或翻译,在基因的转录后水平对靶基因发挥调控作用。家蚕是绢丝类经济昆虫,也是仅次于果蝇的第二大模式昆虫,它既具备其他昆虫共有的生物性状,又具有其自身独特的产绢丝特性。因此,开展家蚕miRNA的研究将有助于揭示miRNAs在家蚕生长发育过程所发挥的调控作用。本实验室前期对家蚕后部丝腺sRNA进行高通量测序,获得35个新的bmo-miRNA。为了验证这些miRNA对丝素基因表达的调控作用,本实验以丝素轻链基因BmFib-L为靶基因,从中筛选对BmFib-L具有调控作用的miRNA,利用半定量RT-PCR方法对它们进行表达分析,并进一步采用双荧光报告基因检测系统在细胞水平验证其对BmFib-L表达的调控作用,取得如下主要结果:1.bmo-miR-0001和miR-0015在BmFib-L mRNA 3′UTR存在靶位点利用RNAhybrid靶基因在线预测软件,以BmFib-L为靶基因,对本实验室在前期Solexa测序获得的35个新bmo-miRNA进行预测,获得2个在BmFib-L mRNA 3′UTR具有潜在结合位点的候选miRNA,即bmo-miR-0001和-0015。在此基础上,设计PCR引物,克隆候选miRNA,进行测序验证。同时对它们的二级结构进行了预测分析,结果表明,bmo-miR-0001和-0015的前体均能形成典型的茎环结构,并包含完整的成熟体miRNA序列且都处于发夹结构的臂上,符合miRNAs二级结构特征。2.bmo-miR-0001和miR-0015具备调控BmFib-L表达的组织特异性条件设计茎环引物,采用RT-PCR方法,对家蚕5龄3d幼虫的头部、表皮、脂肪体、马氏管、精巢/卵巢、丝腺(前、中、后)、气管、中肠和血淋巴细胞等12个不同组织的bmo-miR-0001、-00015和BmFib-L进行了半定量表达分析。结果显示,BmFib-L在后部丝腺的表达水平最高,两个miRNA在后部丝腺的相对表达量都明显高于其他组织,说明它们存在调控BmFib-L基因表达的组织特异性条件。3.Bmo-miR-0001和miR-0015对BmFib-L基因的表达具有抑制作用为进一步验证bmo-miR-0001和miR-0015对BmFib-L的调控作用,分别构建了表达mir-0001和mir-0015的重组质粒pcDNA3.0[ie1-egfp-pri-mir-0001-SV40]和pcDNA3.0[ie1-egfp-pri-mir-0015-SV40],以及表达BmFib-L 3’UTR的重组质粒pGL3[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40],在家蚕BmN细胞中共表达,并以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,通过检测荧光素酶活性,分析mir-0001和mir-0015对BmFib-L表达的调控作用。结果显示,转染miR-0001和miR-0015表达质粒的细胞(实验组)荧光素酶活性极显著低于对照组,表明这两个miRNA对BmFib-L基因的表达具有具有极显著的抑制作用。上述研究结果,有助于更好地理解miRNA的功能,为阐明家蚕miRNA对蚕丝蛋白表达的调控机制提供了新的实验数据。