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研究目的:急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)的一种亚型,其发病机制与PML/RARα融合蛋白的形成密切相关。该融合蛋白可导致髓系细胞的正常分化受阻而停滞于早幼粒细胞阶段,因此导致了 APL的发生。临床上PML/RARα融合蛋白主要存在三种亚型(L,S和V),其中L型和S型为主要亚型,约占总数95%。PML/RARα融合蛋白的形成干扰正常细胞生长、分化、成熟与凋亡,具体表现在以下几个方面:(1)改变PML的核定位。PML/RARα融合蛋白干扰PML核体的形成,抑制PML蛋白的正常活性,从而导致细胞增殖异常和凋亡减少;(2)抑制RARα转录激活的能力。PML/RARα形成同源二聚体与RARα竞争维甲酸反应元件RARE,从而使由RARα所调节靶基因的转录激活被抑制,阻碍髓性细胞的分化成熟,导致M3型AML的发生。除了 APL的发生和发展,PML/RARα对于APL的分化治疗也发挥着重要的作用。目前临床上分化治疗所用的药物全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(ATO)都是通过降解PML/RARα,诱导早幼粒细胞分化为成熟的粒细胞而达到治疗效果。由此可见,PML/RARα融合蛋白的形成是APL的发病基础,而目前临床上APL诱导分化治疗的关键是使致病融合蛋白PML/RARα发生降解。PML/RARα的降解途径主要包括泛素蛋白酶体途径、自噬溶酶体途径和caspase途径,底物蛋白在被降解之前需要在空间构象、亚细胞定位上发生改变才能被不同的降解途径所识别,蛋白翻译后修饰精准的调控着这些变化。PML/RARα融合蛋白已知的翻译后修饰包括SUMOylation和Ubiquitination,这两种修饰均参与PML/RARα融合蛋白的降解调控。NEDDylation是一种类蛋白质翻译后修饰方式,其发生机制与泛素化类似,泛素样蛋白NEDD8在激活酶E1、结合酶E2和连接酶E3的介导下特异性地与底物蛋白相结合。大多数真核生物中NEDD8高度保守,而NEDDylation异常可以导致肿瘤和神经退行性疾病的发生,以上均提示NEDDylation对于细胞内生命活动具有重要调控作用。本课题组在前期研究发现PML/RARα融合蛋白存在类泛素化NEDDylation修饰,且该修饰对于PML/RARα的蛋白稳定性发挥了重要的调控作用。关于PML/RARα的NEDDylation翻译后修饰目前尚未见文献报道。因此,本课题进一步研究NEDDylation对于PML/RARα融合蛋白的调控作用及其分子机制,探讨抑制NEDDylation对于APL分化的诱导作用,为临床上治愈APL提供新的治疗方法。研究方法:选用人早幼粒细胞白血病细胞NB4和非洲绿猴SV40转化的肾细胞COS-7为主要研究对象,考察急性早幼粒细胞白血病细胞中PML/RARα融合蛋白发生NEDD yl ati o n修饰的分子机制及其对急性早幼粒细胞白血病细胞分化的作用研究。采用免疫沉淀技术考察PML/RARα的NEDDylation修饰水平;采用质粒瞬时过表达结合免疫沉淀技术考察PML/RARα的NEDDylation修饰水平的变化;采用shRNA干扰技术联合慢病毒感染沉默细胞中的NEDDylation E2酶;采用给予NEDDylation 抑制剂 MLN4924 和沉默 NEDDylation E2 酶的方法,通过 western blot检测PML/RARα的蛋白水平;采用免疫荧光法检测NEDDylation抑制剂MLN4924对核体形成的影响。采用血细胞计数板计数结合台盼蓝拒染法考察NEDDylation被抑制后对细胞增殖和存活的影响,描绘细胞增长曲线;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达水平;采用硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测PML/RARα的NEDDylation被抑制后对APL细胞的分化作用。研究结果:(1)PML/RARα能发生NEDDylation修饰:在COS-7细胞中过表达HA-PML/RARα,免疫沉淀结果显示PML/RARα能与NEDD8发生共价结合,给予NEDDylation特异性E1酶抑制剂MLN4924,PML/RARα与NEDD8的共价结合被明显抑制。相应地,在COS-7细胞中过表达HA-PML/RARα和deNEDDylation酶NEDP1,免疫沉淀结果显示NEDP1能使PML/RARα的NEDDylation发生下调。同时过表达PML/RARα和NEDDylation的E2结合酶UBC12,相比于单过表达PML/RARα组,质粒共同过表达组PML/RARα的NEDDylation明显增强,在此基础上,将UBC12发挥功能的酶活位点突变,PML/RARα的NEDDylation受到抑制。通过在COS-7细胞上单独过表达HA-PML和HA-RARα,免疫沉淀结果显示RARα存在NEDDylation修饰,PML不存在NEDDylation修饰。以上实验表明,PML/RARα能发生NEDDylation修饰,并且发生修饰的位置可能位于PML/RARα的RARα部分。(2)PML/RARα的NEDDylation对蛋白稳定性的影响:不同浓度的NEDDylation特异性抑制剂MLN4924作用NB4细胞0、24和48小时后,采用western blot技术检测PML/RARα的蛋白水平,结果表明PML/RARα蛋白水平在药物作用48小时后发生明显下降;采用shRNA干扰技术联合慢病毒感染沉默NB4细胞中NEDDylation 的 E2 结合酶,抑制 PML/RARα 的 NEDDylation。Western blot 结果显示shUBC12#1和shUBC12#3可以下调PML/RARα的表达,shUBC12#2相对较弱。以上实验表明,NEDDylation能稳定PML/RARα蛋白。(3)PML/RARα的NEDDylation对PML/RARα核体形成的影响:Hela细胞或COS-7外源性过表达HA-PML/RARα,给予不同浓度的MLN4924(0、0.125、0.25和0.5 μM)作用48小时后,采用免疫荧光检测核体形成,结果显示,0.25 μM和0.5 μM的MLN4924作用48小时后促进核体形成。相应地,给予0.5 μM的MLN4924作用不同时间点(0、12、24和48小时)后,核体形成逐渐明显。以上实验表明,抑制PML/RARα的NEDDylation会促进PML/RARα核体的形成。(4)PML/RARα的NEDDylation对急性早幼粒细胞白血病细胞的分化作用:采用shRNA干扰技术联合慢病毒感染沉默NB4细胞中的NEDDylation结合酶E2。台盼蓝和血细胞计数板计数结果显示,shUBC12#1和shUBC12#3可以明显抑制NB4细胞的增殖;流式细胞术检测CD11b的表达,结果表明,UBC12沉默第五天,shUBC12#1 和 shUBC12#3 的 CD11b 阳性率达到了 18.3±1.3%和 16.0±5.4%。硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验的结果进一步证实了抑制NEDDylation能诱导NB4细胞分化。以上实验结果表明,抑制PML/RARα的NEDDylation促进急性早幼粒细胞白血病细胞的分化。研究结论:本研究发现APL的关键致病蛋白PML/RARα是NEDDylation的新底物蛋白,能与NEDD8发生相互作用。PML/RARα融合蛋白可发生NEDDylation修饰进而使蛋白稳定性增加;应用NEDDylation的特异性抑制剂MLN4924或者沉默shUBC12能下调PML/RARα蛋白的表达。此外,抑制PML/RARα的NEDDylation能明显促进核体的形成和APL的分化。本研究不仅发现了 PML/RARα新的翻译后修饰,而且提示抑制PML/RARα的NEDDylation可能可以作为急性早幼粒细胞白血病分化治疗的潜在策略。