急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上一种常见的急性腹部疾病,约有15~20%的患者发展成为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP的病情发展迅速,并发症多,因而在临床上死亡率一直居高不下。在SAP发展的早期阶段,肺部是首先受到损伤的胰外器官,造成急性肺损伤(acute lung injury,ALI),ALI的进一步发展可以导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),ARDS是SAP早期死亡的重要原因。SAP导致ALI的发病机制有多方面的因素,涉及到内毒素、肠屏障、微循坏、炎性介质和细胞因子连锁反应等多个相关的环节。机体过度失控的炎症反应以及促炎介质的大量释放可能是在ALI的发生中起关键性作用的因素,这一点国内外专家和学者已经形成共识。前B细胞克隆增强因子(pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF)是一种肽类激素,作为具有促进B前体细胞成熟功能的细胞因子于1994年首次被发现。PBEF的主要生理学功能为调控B细胞的细胞增殖、分化、凋亡等。2005年,美国学者叶水清教授等对ALI动物模型和病人的PBEF基因多态性进行了研究,发现PBEF在ALI诊断中具有生物标志作用,也提示其在急性肺部疾病的基因诊断中具有潜在的应用价值。研究表明,PBEF参与了脓毒症患者和机械通气所致的急性肺损伤。在对一些疾病的研究中还发现,PBEF可以延缓中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)凋亡,PMN的凋亡延迟会导致炎症因子释放增多,加重炎症反应。有学者在对急性胰腺炎的研究发现,患者血液中的PBEF表达量与疾病发展程度呈正相关。多年的临床观察和实验研究已经证实,中药清胰汤通过通里攻下、清热解毒、活血化瘀、疏肝理气等机制能够有效治疗急性胰腺炎,并在临床上得到了广泛的应用。其组方中的大黄和芒硝为是典型的通里攻下药,也是《伤寒论》经典名方——大承气汤的主要组成部分,具有峻下热结、软坚润燥、破痞除满等功效。大黄的主要活性成分——大黄素(emodin)已被证实具有多种药理学功能。近年来的研究发现,清胰汤可以减轻sap导致的炎症反应、改善sap导致的器官损伤等等,对于防止sap的进一步发展发挥重要作用。虽然对于清胰汤在sap中的作用已经有较多报道,但是对于清胰汤在sap中的作用机制仍不十分清楚。本课题主要探讨清胰汤及大黄的主要活性成分大黄素是否通过抑制pbef、促进pmn细胞凋亡而对sap发挥治疗作用,以期从新的角度探讨急性胰腺炎肺损伤的发病机制。并进一步探究清胰汤治疗sapali的作用机理,为临床上中西医结合治疗重症急性胰腺炎肺损伤提供进一步的实验依据。本研究制备了sap-ali大鼠模型,检测了对照组、sap模型组、药物处理组大鼠血清淀粉酶的含量,并对肺、胰组织进行he染色及tunel染色观察组织病理特征以及细胞凋亡情况,检测肺、胰组织的湿/干重比来评估组织水肿情况,综合探究清胰汤对sap大鼠的治疗作用;通过免疫组化方法观察肺、胰组织中pbef蛋白的表达情况,通过real-timepcr和westernblot实验观察外周血pmn中pbef的基因和蛋白的表达情况;并对外周血pmn细胞进行凋亡检测以及凋亡相关蛋白的表达情况,探究清胰汤对肺和胰腺组织中pbef的表达及pmn细胞凋亡的影响。在体外细胞实验中,利用lps刺激外周血pmn细胞模拟体外炎性环境,并用大黄素干预后检测细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达情况。第一部分:清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠急性肺损伤治疗作用的观察目的:观察清胰汤对模型的治疗作用,探讨清胰汤对sap大鼠肺胰组织损伤、组织水肿以及肺胰细胞凋亡的影响。方法:采用向胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠溶液的方法制备大鼠sap模型,用碘-淀粉比色法检测血清淀粉酶水平,用he染色观察肺和胰腺的病理学变化;用tunel法检测肺和胰腺组织中细胞凋亡情况,测量肺、胰组织湿/干重比来评估组织水肿程度。结果:sap大鼠血清淀粉酶水平明显升高,清胰汤能够有效降低淀粉酶水平;he染色结果显示,清胰汤可以改善sap造成的肺和胰组织出血、炎性细胞浸润等情况;湿/干重比检测结果显示,sap模型大鼠的肺、胰组织水肿严重,在经过清胰汤处理之后得到明显改善;tunel检测显示,与sap模型组相比清胰汤处理组大鼠肺、胰细胞凋亡比例明显减轻。结论:清胰汤能够降低sap大鼠血清淀粉酶的水平,能够缓解sap造成的肺、胰组织水肿、细胞坏死等病理学表现,抑制肺、胰细胞凋亡。第二部分:清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤作用机理探讨目的:探讨清胰汤对sap大鼠模型肺和胰腺组织pbef的表达、pmn细胞凋亡的影响及清胰汤治疗sap的分子机制。方法:采用免疫组化检测各组大鼠肺、胰组织中pbef的表达;从大鼠外周血中分离pmn细胞,用real-timepcr法检测pbefmrna水平的表达情况;用westernblot法检测pbef蛋白水平的表达情况;应用annexinv-fitc/pi法对pmn细胞进行染色,并通过流式细胞术检测pmn细胞的凋亡比例;用westernblot检测凋亡相关蛋白fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3、bcl-xl的表达。结果:免疫组化结果显示,在sap大鼠的肺、胰组织中pbef表达量增加,在经过清胰汤处理之后,pbef表达量下降;real-timepcr和westernblot结果显示,在pmn细胞中,清胰汤能够下调pbef的表达;流式细胞术检测pmn凋亡结果显示,sap大鼠的pmn细胞凋亡比例显著低于对照组,经过清胰汤处理之后该比例有明显提高;对其他凋亡相关的蛋白westernblot结果显示,清胰汤上调fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3的表达,下调bcl-xl的表达。结论:清胰汤能够下调sap大鼠肺和胰腺组织pbef的表达,促进sap大鼠的pmn细胞凋亡并影响凋亡相关蛋白的表达。清胰汤可能是通过下调pbef表达来促进pmn细胞凋亡,进而对sap起到治疗作用。第三部分:体外实验研究大黄素对pmn细胞的促凋亡作用目的:通过体外实验进一步验证大黄素能够促进pmn细胞凋亡,探讨大黄素促进pmn凋亡的相关机理。方法:分离正常大鼠外周血中的pmn细胞并用lps诱导细胞模拟体外炎性环境,给予相应的药物处理;运用流式细胞技术,采用annexinv-fitc/pi双染法检测pmn细胞的凋亡比例;用westernblot检测凋亡相关蛋白fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3、Bcl-xL的表达。结果:凋亡检测结果显示,LPS能够显著抑制PMN细胞凋亡,而大黄素能够拮抗这一作用;Western blot得出了与体内实验一致的结果,即大黄素上调了促凋亡基因Fas、FasL、Bax、cleaved caspase-3的表达,下调了抗凋亡基因Bcl-xL的表达。结论:1.大黄素能够促进PMN细胞凋亡;2.大黄素可能通过影响PMN细胞凋亡的死亡受体途径和线粒体途径中相关蛋白的表达促进细胞凋亡;3.通过诱导PMN细胞凋亡,大黄素具有治疗其他炎症反应的潜能。