论文部分内容阅读
目的: 探讨高甲基化抑癌基因HIC1在前列腺癌发展中的作用及分子机制。 方法: (1)采用甲基化特异性PCR(MSP),亚硫酸盐测序PCR(BSP)技术,对前列腺癌细胞和临床标本进行HIC1启动子甲基化分析,并分析经5-Aza-CdR处理前列腺癌细胞后的HIC1启动子甲基化状态;采用RT-PCR和Westem blot分析前列腺癌细胞中HIC1表达水平。 (2)建立HIC1过表达前列腺癌细胞株PC3HIC1、C4-2BHIC1和相应对照株PC3GFP、C4-2BGFP,采用流式细胞仪和体外细胞侵袭等功能实验检测前列腺癌的体外侵袭转移能力。在SCIDd小鼠体内注射PC3HIC1、C4-2BHIC1与对照株,分析形成肿瘤大小;进行小鼠骨X成像、大腿胫骨TRAP染色和小动物Luciferase活体成像,分析HIC1过表达后对前列腺癌形成和转移能力影响的差异。 (3)对细胞株PC3HIC1、C4-2BHIC1和对照株进行基因芯片实验,发现受HIC1调控的差异基因表达谱;采mRT-qPCR、Western blot和流式细胞仪分别对潜在的下游靶基因CXCR-7、E-cadherin、Vimentin和Snail的表达变化进行验证。进行Luciferase报告基因和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,分析在前列腺癌细胞PC3和C4-2B中,HIC1是否和CXCR7的启动子区域进行结合;采用免疫组化实验(IHC)分析注射前列腺癌细胞的SCID小鼠成瘤组织,组织芯片实验分析前列腺癌临床组织标本,验证HIC1是否抑制了CXCR7的表达:使用Westernblot和流式细胞仪分析用5-Aza-cdR处理PC3和C4-2B细胞后,HIC1和CXCR7的表达。进行Westem blot实验分析PC3HIC1、C4-2BHIC1细胞与对照株,IHC分析注射前列腺癌细胞的SCID小鼠的成瘤组织,验证HIC1过表达后与上皮-间质转化(epithelial-mesenchyrmal transition,EMT)有关蛋白质的表达变化。 结果: (1)使用在线分析软件Methprimer预测HIC1基因1亚型转录起始点上游-1,000bp区域内存在3个CpG岛。进行MSP和BSP测序,发现在PC3和C4-2B细胞中,HIC1启动子存在高度甲基化,而在正常前列腺上皮细胞PrEC中,HIC1启动子甲基化程度很低;检测36例人前列腺癌实体瘤和36例人前列腺正常穿刺组织,发现HIC1甲基化比例分别是80.3％和31.56％,有明显差异;用5-Aza-CdR处理前列腺癌细胞株后,发现HIC1启动子甲基化明显降低,未甲基化趋势上升,而HIC1转录和蛋白表达水平均显著上调。 (2)PC3HIC1、C4-2BHIC1与对照株比较,应用流式细胞仪和体外细胞侵袭等功能实验,发现生长速度明显减慢,凋亡率明显增高,细胞迁移能力明显下降,侵袭功能受到显著抑制;体外成瘤实验发现SCID小鼠成瘤能力降低。PC3HIC1与对照株比较,X成像和TRAP染色结果显示骨损毁程度显著减弱,小动物Luciferase活体成像显示骨转移功能明显减弱。 (3)PC3HIC1、C4-2BHIC1。分别与对照株比较,进行基因芯片实验,发现一些下游基因CXCR7、Vimentin和Snail表达受到明显抑制,而E-Cadherin等基因上调表达显著;通过RT-qPCR,Western blot和流式细胞仪发现除CXCR7被下调表达外,与EMT有关的信号通路蛋白的表达发生了改变。深入采用Luciferase报告基因和ChIP实验,证实在前列腺癌细胞中,HIC1与CXCR7启动子发生了结合,抑制了CXCR7活性;在CXCR7启动子中突变其潜在的结合位点(HIC1应答元件,HiRE),HIC1介导的抑制性显著降低。进行IHC分析注射前列腺癌细胞的SCID小鼠的成瘤组织,组织芯片实验分析前列腺癌组织,验证了HIC1抑制了CXCR7表达;采用Western blot和流式细胞仪分析用5-Aza-cdR处理后的PC3和C4-2B细胞,恢复HIC1表达显著,抑制了CXCR7的表达水平。进行Westem blot实验分析PC3HIC1、C4-2BHIC1细胞与对照株,发现HIC1过表达后,E-Cadherin和Vimentin蛋白的表达发生改变,p-AKT(Ser473)和Snail蛋白表达下调。IHC分析验证HIC1过表达后,E-Cadherin蛋白表达上调,Vimentin蛋白表达下调。 结论: (1)在前列腺癌中,抑癌基因HIC1的启动子存在高度甲基化,导致HIC1表达被沉默或下调。 (2)恢复HIC1表达,显著抑制前列腺癌细胞在体外增殖、迁移、转移能力和体内成瘤、骨转移和骨损伤。 (3)CXCR7是HIC1调控的重要下游靶基因,HIC1蛋白与CXCR7启动子结合,特异性介导对CXCR7的抑制作用。在前列腺癌中,HIC1启动子高度甲基化使其表达下调,降低了对CXCR7的抑制作用,可能在前列腺癌的发展中发挥作用。 (4)HIC1可能介导EMT的发生,与前列腺癌发展存在相关性。 (5)本研究提示,HIC1可作为前列腺癌治疗潜在的靶标。