论文部分内容阅读
目的:通过高果糖饮食诱导非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型以及衣霉素诱导HepG2细胞模型,观察中药祛湿化瘀方对肌醇需求酶1α(IRE1α)-剪切后的X盒结合蛋白1(XBP1s)通路及肝脏脂质从头合成(DNL)的作用及其主要效应成分,以期阐明祛湿化瘀方抗NAFLD的作用机制。方法:本论文分为体内体外两部分。第一部分:祛湿化瘀方对高果糖NAFLD小鼠模型IRE1α-XBP1s通路介导肝脏脂质从头合成的作用研究1.运用高果糖饮食诱导的小鼠NAFLD模型,以正常饮食为对照,设计Day0、Day3、Week1、Week2和Week4等5个不同观察时间点,观察每个时间点肝脏胰岛素抵抗(IR)、肝组织病理变化、肝组织甘油三酯(TG)及DNL含量、肝脏输入与输出脂质的情况、肝脏TG及DNL合成关键酶表达情况、肝脏碳水化合物反应元件结合蛋白(CHREBP)及固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)表达情况和IRE1α-XBP1s通路的变化情况。2.运用2W高果糖饮食诱导的小鼠NAFLD模型,以正常饮食为对照,通过祛湿化瘀方低、中、高剂量组的设计,观察祛湿化瘀方对肝脏IR、肝组织病理、肝组织TG及DNL含量、肝脏输入与输出脂质、肝脏TG及DNL合成关键酶表达、肝脏CHREBP及SREBP1表达、肝脏IRE1α-XBP1s通路变化的作用。第二部分:祛湿化瘀方对衣霉素体外诱导HepG2细胞活化IRE1α-XBP1s通路的作用及其主要效应成分研究1.运用不同浓度衣霉素体外诱导HepG2细胞,设对照空,观察不同浓度衣霉素对细胞内TG、NEFA以及IRE1α-XBP1s通路的作用。2.运用衣霉素体外诱导HepG2细胞模型,观察祛湿化瘀方药物血清对细胞内TG、NEFA以及IRE1α-XBP1s通路的作用。3.利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析鉴定给予祛湿化瘀方后大鼠血清中潜在的入血成分。4.运用CCK8(Cell Counting Kit 8)检测祛湿化瘀方入血成分栀子苷、白藜芦醇、山萘酚、虎杖苷、京尼平、木犀草素及绿原酸对HepG2细胞的药物毒性。在药物安全剂量范围内,运用衣霉素体外诱导HepG2细胞模型,观察它们对IRE1α-XBP1s通路介导DNL的作用。结果:第一部分:祛湿化瘀方对高果糖NAFLD小鼠模型IRE1α-XBP1s通路介导肝脏脂质从头合成的作用研究1.随着造模时间的延长,与正常对照组比较,高果糖饮食组小鼠肝组织胰岛素抵抗和肝组织病理变化明显加重,血清、肝脏的TG与NEFA含量显著升高,肝组织TG合成关键酶甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT1)、酰基甘油3-磷酸酰基转移酶(AGPAT)、二酰甘油酰基转移(DGAT2)、磷脂酸磷酸酶(PAP)和DNL关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)mRNA显著升高,CHREBP及SREBP1 mRNA显著升高,磷酸化的IRE1α和XBP1 s蛋白以及XBP1s mRNA表达明显升高。2.祛湿化瘀方可以明显改善2W高果糖小鼠NAFLD模型中胰岛素抵抗和肝组织病理变化,显著降低血清、肝脏的TG与NEFA含量,降低肝组织TG合成关键酶GPAT1、AGPAT、DGAT2、PAP mRNA和蛋白表达,降低肝组织DNL关键酶 ACC、FAS、SCD1 mRNA 和蛋白表达;下调 CHREBP 及 SREBP1 mRNA表达,但是对CHREBP及SREBP1核蛋白表达以及SREBP1转录活性无明显抑制作用;下调磷酸化的IRE1α和XBP1s总蛋白以及XBP1s mRNA与核蛋白表达。第二部分:祛湿化瘀方对衣霉素体外诱导HepG2细胞活化IRE1α-XBP1s通路的作用及其主要效应成分研究1.采用胎牛血清培养细胞。与对照组比较,0.5 μg/ml和1μg/ml衣霉素刺激HepG2细胞24小时后可以明显升高细胞内TG与NEFA含量,上调XBP1s以及受XBP1s调控的DNL的靶基因ACACB、SCD1 mRNA表达。2.采用大鼠血清培养细胞。祛湿化瘀方大鼠药物血清对1μg/ml衣霉素体外诱导HepG2细胞内TG无抑制作用。此外,用正常大鼠血清培养细胞,0.5μg/ml和1μg/ml衣霉素刺激HepG2细胞24小时后,与对照组比较,细胞内TG无明显统计学差异。上述结果可能与采用大鼠血清培养的干扰因素有关。3.通过与祛湿化瘀方提取物与标准对照品对比分析,结合提取离子流图与质谱图,最终确认了口服祛湿化瘀方后大鼠血清样品中7种主要的入血成分,即栀子苷、白藜芦醇、山萘酚、虎杖苷、京尼平、木犀草素及绿原酸。4.采用胎牛血清培养细胞。在药物安全剂量范围内,发现祛湿化瘀方入血成分栀子苷、绿原酸和虎杖苷可以明显降低1μg/ml衣霉素体外诱导HepG2细胞模型中细胞内XBP1s mRNA表达,降低细胞内TG、DNL含量以及XBP1s靶基因ACACB、SCD1 mRNA 表达,降低 p-IRE1α、XBP1s、ACACB 和 SCD1 蛋白表达。结论:1.祛湿化瘀方可通过调节IRE1α-XBP1s通路,抑制肝脏DNL,从而防治NAFLD。2.栀子苷、绿原酸和虎杖苷是祛湿化瘀方在调节IRE1α-XBP1s通路抑制肝脏DNL从而防治NAFLD的重要效应物质基础。