【摘 要】
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目的:A激酶锚定蛋白（AKAP）5是AKAP家族中的一种支架蛋白。既往研究报导以及我们前期实验研究都发现,AKAP5参与了心肌梗死后的心肌重构。然而AKAP5是否参与了心肌细胞的凋亡尚不清楚。本研究通过体外实验探究AKAP5是否参与了缺复氧诱导的心肌细胞的凋亡及其潜在的机制。方法:体外培养大鼠胚胎心肌细胞H9C2,过表达AKAP5后构建缺复氧（Hypoxia and Reoxygenation,H
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目的:A激酶锚定蛋白（AKAP）5是AKAP家族中的一种支架蛋白。既往研究报导以及我们前期实验研究都发现,AKAP5参与了心肌梗死后的心肌重构。然而AKAP5是否参与了心肌细胞的凋亡尚不清楚。本研究通过体外实验探究AKAP5是否参与了缺复氧诱导的心肌细胞的凋亡及其潜在的机制。方法:体外培养大鼠胚胎心肌细胞H9C2,过表达AKAP5后构建缺复氧（Hypoxia and Reoxygenation,H/R）模型。缺复氧前,使用PKA抑制剂H89（5μM）和St-Ht31（50μM）分别孵育10分钟和30分钟。缺复氧建模后检测各组心肌细胞中的乳酸脱氢酶（LDH）的释放率以及采用CCK-8试剂检测细胞活力;细胞凋亡采用流式细胞仪进行检测;免疫荧光和免疫共沉淀检测AKAP5与PKA、受磷蛋白（phospholamban,PLN）的定位和相互作用情况;蛋白质印记法检测BAX、Cleaved caspase3以及BCL-2蛋白以及受磷蛋白（PLN）、磷酸化的受磷蛋白（P-PLN）、肌浆网/内质网钙ATP酶（SERCA2a）以及AKAP5表达水平的变化。结果:H/R诱导后H9C2细胞中的AKAP5蛋白的表达水平明显降低,细胞活力也有显著的降低,LDH释放率升高,心肌细胞的凋亡率明显地升高,凋亡相关蛋白明显改变,磷酸化的PLN的表达和SERCA2a的表达也明显下降了。过表达AKAP5可显著提高H9C2细胞存活率和降低LDH水平,逆转凋亡相关蛋白表达;P-PLN/PLN和SERCA2a表达水平显著增加。抑制PKA活性后,与H/R+H-89+AKAP5过表达组相比,H/R+H-89组的PLN磷酸化水平和SERCA2a表达明显减少,凋亡增加。而H/R+AKAP5过表达组PLN磷酸化水平和SERCA2a表达明显增加,凋亡减少。我们使用了PKA抑制剂H-89后,发现与H/R组相比,H/R+H-89组H9C2细胞的凋亡明显升高了。BAX、Cleaved caspase3蛋白的表达较H/R组明显地增加,蛋白Bcl-2的表达明显减少。PLN磷酸化和SERCA2a蛋白表达水平明显减少。与H/R+H-89组相比,H/R+H-89+AKAP5组细胞凋亡率明显减轻。BAX蛋白减少、蛋白Cleaved caspase3的表达明显减少,同时蛋白Bcl-2表达情况则明显增加。PLN磷酸化表达水平和SERCA2a蛋白表达水平增加。与H/R+AKAP5组相比,H/R+H-89+AKAP5组细胞凋亡率显著增加,BAX、Cleaved caspase3蛋白明显增加,Bcl-2蛋白表达明显减少。PLN磷酸化表达水平和SERCA2a蛋白表达水平明显减少。在使用一种扰乱AKAP与其调节亚基相作用的抑制肽St-Ht31后,发现与H/R组相比,H/R+St-Ht31组心肌细胞BAX、蛋白Cleaved caspase3的表达情况发现显著升高,同时Bcl-2蛋白表达情况则明显的下降。与H/R+AKAP5+St-Ht31组相比,H/R+AKAP5组心肌细胞蛋白BAX和蛋白Cleaved caspase3的表达情况显著被抑制了,而明显提升了Bcl-2蛋白表达。免疫荧光和免疫共沉淀发现AKAP5与PLN和PKA存在共定位和相互作用。结论:在缺复氧诱导的H9C2心肌细胞中,AKAP5表达水平显著降低。AKAP5过表达可减轻H/R诱导的心肌细胞的凋亡,其机制是通过锚定PKA介导PLN/SERCA通路调控心肌细胞的凋亡。
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