【摘 要】
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急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种以不成熟克隆髓系细胞增殖和异常分化为特征的高异质性血液恶性肿瘤。AML患者的发病中位年龄为67岁,5年生存率只有29.5%。其中60岁以上老年患者的无病生存率(Disease-free survival,DFS)不足10%,生存期(Overall survival,OS)小于1年。AML的治疗主要以化疗(核苷类阿糖胞苷与蒽
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急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种以不成熟克隆髓系细胞增殖和异常分化为特征的高异质性血液恶性肿瘤。AML患者的发病中位年龄为67岁,5年生存率只有29.5%。其中60岁以上老年患者的无病生存率(Disease-free survival,DFS)不足10%,生存期(Overall survival,OS)小于1年。AML的治疗主要以化疗(核苷类阿糖胞苷与蒽环类药物联合)和造血干细胞移植为主。虽然化疗可使AML患者达到临床缓解,但易产生耐药性、复发率高、预后不良等问题。因此,亟需新的治疗方案以改善AML患者,尤其复发和耐药患者的预后。细胞凋亡的失调在癌症发生、发展和化疗耐药中起关键作用。抗凋亡蛋白Mcl-1在细胞生存中起关键作用,并在AML中高表达。而且高水平Mcl-1与AML复发相关,显示Mcl-1是一个潜在的AML治疗靶点。AZD5991是高亲和力的Mcl-1选择性抑制剂,在临床前研究中显示出较好的抗血液肿瘤效果,然而单药治疗常常因内源性或获得性耐药而失败。因此,确定潜在靶点以增强AZD5991的抗AML活性至关重要。转录因子c-Myc被认为与Mcl-1共同调控AML细胞的存活与增殖。c-Myc是原癌基因Myc家族蛋白成员之一,在细胞生长、增殖、凋亡、代谢等多个过程中发挥关键作用。c-Myc表达异常会促进肿瘤的发生、发展以及化疗耐药。而且,c-Myc在AML中过度表达,并被证明是AML发病的一个关键因素。由此,我们推测c-Myc在Mcl-1抑制剂AZD5991的抗AML活性中起关键作用。为验证该假说,我们首先应用流式细胞术、Bax、Bak沉默和Co-IP实验证明AZD5991通过释放Bim诱导AML细胞发生内源性凋亡。接下来,我们通过流式细胞术检测不同AML细胞系和患者临床样本对AZD5991的敏感性,Western Blotting实验检测c-Myc、Mcl-1、Bcl-2和Bcl-x L本底蛋白水平。结果显示,不同细胞系和临床样本对AZD5991的敏感程度相差较大,本底c-Myc蛋白水平与AZD5991 EC50s成负相关。我们用另一种Mcl-1抑制剂S63845得到相似结果。这预示c-Myc在Mcl-1抑制剂的抗AML活性中起关键作用。随后,在构建的AZD5991耐药细胞系中,我们发现c-Myc抑制剂10058-F4能够克服细胞对AZD5991的获得性耐药,显示c-Myc蛋白水平是Mcl-1抑制剂抗AML活性的潜在生物标志物。进一步,我们发现10058-F4可在AML母本细胞系、临床样本细胞和AZD5991获得性耐药细胞系中下调Mcl-1,并协同增加AZD5991诱导的AML细胞凋亡。接下来,我们分别从转录、蛋白质翻译和蛋白稳定性方面入手探索10058-F4下调Mcl-1的作用机制,通过RT-PCR、加入综合应激反应抑制剂ISRIB和蛋白质稳定性实验最终确定10058-F4通过增加e IF2的磷酸化抑制蛋白质翻译下调Mcl-1。上述结果预示,同时靶向c-Myc和Mcl-1预示可能产生更好的杀伤AML效果。我们通过流式细胞术检测细胞凋亡以及集落形成实验检测对祖细胞的影响。结果表明,AZD5991与10058-F4联合应用在AML细胞系和临床样本中具有较好协同杀伤AML效果,并对AML祖细胞集落形成产生更强抑制作用。在用药安全性方面,AZD5991与10058-F4联用对健康人外周血细胞凋亡以及正常造血祖细胞集落形成能力影响有限,预示两药联合具有很好的肿瘤选择性和安全性。耐药是限制AML化疗效果的主要障碍。c-Myc和Mcl-1均在化疗耐药中起重要作用,预示对二者的抑制会对化疗耐药细胞产生有效杀伤。于是,我们构建4株对一线AML化疗药物阿糖胞苷(Cytarabine,Ara C)耐药的细胞系,并证明AZD5991与10058-F4在Ara C获得性耐药细胞中同样具有良好的协同抗AML活性。同时,两药在化疗复发的AML临床样本细胞中也展示出良好的联合效果。上述数据预示,同时靶向Mcl-1和c-Myc具有治疗复发和化疗耐药AML的潜力。综上所述,c-Myc蛋白水平与AZD5991的抗AML活性呈正相关;抑制c-Myc可通过抑制蛋白质合成方式下调Mcl-1,并使AZD5991获得性耐药AML细胞重新敏感;同时抑制c-Myc和Mcl-1在AML细胞系、临床样本、Ara C获得性耐药细胞系和化疗后复发临床样本细胞中均显示出良好的协同抗AML活性,并且具有很好的肿瘤选择性。我们的结果为同时抑制c-Myc和Mcl-1治疗AML提供了数据与理论基础,为化疗耐药或复发的AML患者提供了新的治疗思路。
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