论文部分内容阅读
莽草酸(shikimic acid)是芳香族氨基酸合成中的重要中间产物，具有广泛的药用价值，是抗流感药物“达菲”的重要合成前体。微生物发酵生产莽草酸具有许多优点，其中大肠杆菌常应用于微生物大规模发酵生产。通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，是构建工业化莽草酸高产菌的主要技术手段。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，PTS)是大肠杆菌细胞内参与葡萄糖从膜间质转运和磷酸化到胞内的主要活性转运系统，影响莽草酸合成前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的利用率。通过对PTS系统的定向修饰和改造，调节细胞内代谢流向，提高碳源利用率，增加莽草酸前体合成量，结合对代谢途径中的特定修饰，能够构建出较为理想的莽草酸高产菌。本研究从E. coli W3110野生型大肠杆菌出发，根据细胞代谢网络分析，利用Red同源重组的方法对PTS系统进行修饰改造，敲除PTS系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因(ptsG)，磷酸组氨酸搬运蛋白HPr的编码基因(ptsI)，同时敲入来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖易化体蛋白(glucose facilitator)编码基因(glf)，构建重组大肠杆菌，较系统地考察了基因删除和插入对细胞的生长、葡萄糖代谢以及副产物乙酸积累的影响。敲除基因ptsG和ptsI造成大肠杆菌PTS系统部分功能缺失，细胞生长受到一定限制，敲入glf基因后，重组大肠杆菌能够利用Glf-Glk(葡萄糖易化体-葡萄糖激酶)途径，消耗ATP将葡萄糖进行磷酸化并转运进入细胞。通过该途径转运葡萄糖能够提高葡萄糖利用效率，降低副产物乙酸生成，同时能够使更多的碳代谢流进入后续合成途径，预期能够提高产物产量。为更好地提高目的产物莽草酸产量，本研究在对PTS系统进行改造的基础上，敲除了合成途径中的莽草酸激酶基因aroL和aroK，构建了莽草酸合成菌。比较了敲除前后菌株的生长和产物生成情况，挑选出一株生长较好，莽草酸合成量较高的重组菌S5，使用初始发酵培养基进行摇瓶发酵，产量为193.85mg L-1。同时，在表达载体pETac上加强表达了莽草酸合成途径中的限速酶3-脱氢奎宁酸合酶(AroB)和莽草酸脱氢酶(AroE)，拓宽代谢通路；表达解除底物反馈抑制作用的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶基因aroFfbr，增加前体合成量，构建重组质粒pEtac-EBFfbr，导入S5中。发酵结果显示，经过改造后的重组菌S5(pEtac-EBFfbr)莽草酸产量由193.85mg L-1提高到345.36mg L-1，提高了78%。为了进一步提高重组菌S5(pEtac-EBFfbr)发酵特性，本研究中对初始发酵培养基中的各影响因素进行了初步探究。选择了一种较优的培养基配方组合，经摇瓶发酵，重组菌莽草酸产量为2766mg L-1，转化率提高6.5倍。采用该培养基进行6L发酵罐实验，莽草酸产量达到15.12g L-1，该重组菌株为构建高产芳香族氨基酸重组菌打下了基础。