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VHL (von Hippel-Lindau)疾病是一种罕见的常染色体显性遗传病,其发病率为1/3.6万,平均发病年龄为26.3-30.9岁。VHL作为一个肿瘤抑制子,缺失或者失活将会导致一系列的肿瘤发生。VHL与Cul-2、Elongin B、Elongin C和Rbx1在体内形成一个CRL E3泛素连接酶复合物促进底物蛋白如HIF1α发生蛋白酶体方式的降解。目前发现VHL缺失或者突变导致肿瘤发生是因为HIF1α不能被降解,而在细胞质中积累并移位到细胞核中与HIF1β组成异源二聚体,成为一个有功能的转录因子激活一些基因的转录,如GLUT-1、PDGF、CA-IX、 VEGF和TGFα等。作为E3泛素连接酶中的一个组分,VHL可以促进HIF1α、 SUMO修饰的HIF-2α、hsRPB7、β-catenin、Dv12、STRA13和ER-a发生泛素化降解。虽然现在找到了一些VHL调控的靶蛋白,但是作为在肿瘤发生过程中起着重要作用并广泛表达的蛋白质,其它受VHL调控的底物仍然有待发现。本研究通过建立一种改进的酵母双杂交方法来寻找新的VHL调控的靶蛋白。主要结果如下：1.建立了一种改进的酵母双杂交方法通过改进文库扩增方式,转化和筛选的过程,建立了一种改进的酵母双杂交的方法,克服了传统酵母双杂交方法操作复杂、难以寻找低丰度的基因所表达蛋白质的互作、假阳性和假阴性多的缺点。2.用建立的酵母双杂交方法筛选与VHL相互作用的蛋白质通过酵母双杂交筛选,以鼠源的VHL为“诱饵”,在人的胎脑cDNA文库中初步筛选到了25个与之互作的蛋白质。通过回转验证发现4个与VHL互作比较强,分别是Dv12、UXT、PFDN5和RANBP9,并对VHL-Dv12和UXT-VHL进行了深入研究。3.VHL促进Dvl2发生UB-K48-位连接的泛素化通过详细的泛素化分析,结果显示,VHL可以促进Dvl2的301位赖氨酸残基与K48-位连接的多泛素化链连接从而导致Dvl2发生泛素化依赖的蛋白酶体降解。4.VHL与UXT互作调控AR的转录激活活性通过酵母双杂交筛选得到的与VHL互作的蛋白质UXT是雄激素受体AR的辅因子。GST pull-down.免疫共沉淀以及核质分离实验表明UXT与VHL在细胞核中相互作用。VHL能直接与AR的DBD和Hinge区域结合,诱导AR发生非典型的泛素化。在有雄激素DHT刺激的条件下,VHL与AR互作能够提高AR的转录激活活性。通过RNAi手段降低细胞中的VHL表达水平,AR的泛素化水平和转录激活活性都随之降低。研究结果表明,VHL和UXT之间的相互作用以及VHL诱导的AR的泛素化能够调控AR的转录激活活性。