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与传统的遗传标记不同,分子标记可以从DNA水平上体现出物种的遗传多样性,其中微卫星DNA标记由于具备诸多优点,通常被认为是群体遗传多样性分析的理想标记。微卫星标记用于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)群体遗传学分析的研究已有一些报道,然而之前报道由于采样时间较早、水域不同加之中华绒螯蟹(河蟹)野生群体的生存繁衍处在动态变化中,长江、黄河、辽河三个主产水系的遗传现状尚存在不确定性,进一步的种质评价工作有待进行。本研究针对中华绒螯蟹种群遗传多样性的微卫星分析这一目标,为更好的开展微卫星分子标记在河蟹种群遗传分析上的应用,首先从优化DNA提取方法入手,然后比较优选微卫星PCR产物分型技术,最后通过对长江、黄河和辽河三个水系野生河蟹种群的遗传结构加以分析,以期获得河蟹主产水系野生群体的当前的种质资源状况,对河蟹遗传育种工作提供基础资料。1.为优化中华绒螯蟹基因组DNA提取方法,本试验采用酚-氯仿法和吸附柱型试剂盒分别对中华绒螯蟹的鳃、肌肉、血淋巴液和刚毛4种组织进行DNA提取,并从纯度、浓度、片段完整性及微卫星标记PCR扩增效果共4个方面评价提取DNA的质量。结果显示:使用酚-氯仿法提取得到的DNA片段比用试剂盒提取的更完整,且DNA的浓度较高,但纯度稍低;两种提取方法,刚毛和血淋巴液中的DNA纯度都高于鳃和肌肉,4种组织中的DNA含量依次为鳃>肌肉>刚毛>血淋巴液,未剪碎刚毛中未能提取到基因组DNA;微卫星标记PCR产物的电泳条带表明,两种提取方法下4种组织中提取的DNA质量均可满足微卫星标记的应用要求。最终建立起一种简便的非损伤性中华绒螯蟹的采样及其DNA提取方法,这对于进行中华绒螯蟹遗传育种和分子标记研究等方面具有积极作用。2.为对比荧光标记分型技术和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对微卫星等位基因分型的效果,本试验选择6对微卫星引物,对60个中华绒螯蟹个体的总DNA分别进行PCR扩增。荧光标记法共检测出等位基因129个,平均每个位点21.5个等位基因,聚丙烯酰胺凝胶电泳共检测出等位基因174个,平均每个位点29个等位基因。对位点Esin67的PCR产物分别进行重复检测,发现荧光标记法的重复率为100%,而聚丙烯酰胺凝胶电泳法两次结果存在较大差异,该结果证实了荧光标记法在检测的可靠性显著的高于聚丙烯酰胺凝胶电泳。对两种方法的检测效率和经济成本的分析表明,荧光标记法虽然成本较高,但效率亦高于聚丙烯酰胺凝胶电泳法。建立单重PCR产物的多重毛细管电泳分型技术是提高效率、降低成本的有效途径。3.利用23个微卫星标记,对3个水系(长江、黄河、辽河)河蟹的野生群体进行遗传多样性及遗传结构分析。共检测到745个等位基因,各位点平均等位基因数为31个。遗传多样性分析显示,23个微卫星座位的平均多态信息含量(PIC)为0.894,其中22个为高多态性位点(PIC>0.5)。所有位点平均观测杂合度为0.736,平均期望杂合度为0.903,有多个座位在不同群体中偏离哈代-温伯格平衡,总体上处于杂合子缺失状态。3个群体均表现出较高的遗传多样性水平(HO=0.725-0.752,I=2.729-2.769);香农信息指数(I)显示3群体的遗传多样性水平依次为:黄河群体>长江群体>辽河群体。AMOVA分析结果显示,99.76%的变异来源于种群内部和个体内部,群体遗传分化指数FST=0.0022-0.0056,群体间的遗传分化处于较低水平(FST<0.05)。基于Nei’s遗传距离的UPGMA聚类结果显示,黄河群体和辽河群体聚为一支,长江群体单独聚为一支。瓶颈效应分析显示,所有群体近期均经历了有效种群大小的降低。种群遗传结构分析未能成功划分最佳理论群体数,表明3个野生群体均存在一定程度的基因混杂。对3个河蟹主产水系的野生群体进行遗传多样性及遗传结构分析结果表明以下问题:河蟹3个主产水系的野生具有较高的遗传多样性,作为育种基础群体进行遗传改良的潜力较大;地理种群间存在一定的遗传分化,与地理距离呈现一定的相关性;3个群体较低的遗传分化程度以及较为混乱的遗传结构,均暗示了养殖活动中的大规模跨地域引种以及养殖群体的逃逸等原因都可能会造成流域间天然河蟹种群的种质混杂。