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目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）的病毒中间体前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）在逆转录形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,ccc DNA）的过程中,会形成双链线性DNA（double-stranded linear DNA,dsl DNA）,部分dsl DNA可整合到宿主基因组上。病毒等染色体外的DNA并入宿主染色体DNA的基因重组的过程称之为基因整合。HBV-DNA与宿主基因的基因整合与慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）相关终末期肝病尤其是原发性肝癌的发生、发展密切相关。到目前为止已有多种方法用于检测HBV-DNA在宿主基因组的整合,但这些检测方法在敏感性、特异性、费用方面各有优劣,综合考虑以上各方面,本研究采用反向巢式PCR（Inverse Nested PCR,Inv PCR）的检测方法以及数据模拟的数学及统计学分析方法得出慢乙肝相关终末期肝病患者肝组织中HBV-DNA在宿主染色体DNA上的整合位点和整合频率。初步探讨慢乙肝相关终末期肝病患者肝组织中HBV-DNA基因整合位点和整合频率及其与临床特征的关系。方法:首先提取不同的慢乙肝相关终末期肝病患者（包括2例肝炎肝硬化和6例原发性肝癌患者）的肝组织DNA,使用设计好的引物扩增出s基因的非保守区序列,通过BLAST比对,以明确患者的HBV基因型。根据不同的基因型选择不同的限制性内切酶（restriction enzyme,RE）和反向巢式PCR引物。对提取的肝组织DNA进行反复的酶切和酶接,得到反向套嵌DNA片段（inverted DNA）,该片段两端是HBV序列,中间镶嵌的是宿主基因组的一段序列。反复酶切和酶接形成反向套嵌DNA片段以后,对该片段进行纯化浓缩,处理后的DNA片段作为巢式PCR的模板。使用倍比稀释法预处理DNA模板,巢式PCR扩增出病毒细胞连接片段（virus-cell DNA junction,VCJ）,使用琼脂糖凝胶电泳证明VCJs存在,将VCJs切胶、回收并进行测序,然后与宿主基因组进行比对,便可以得到HBV-DNA的整合位点,不同的整合片段对应不同的整合位点。统计各个整合位点在不同稀释度下的个数,结合DNA损失量,进行数据模拟,取95%的置信区间可以得出每个整合位点的整合频率的范围,取每个整合位点的最大整合频率。在Hep G2.2.15细胞和Hep G2细胞中验证该方法。检测慢乙肝相关终末期肝病患者的肝组织中HBV-DNA的整合位点、计算整合频率,分析慢乙肝相关终末期肝病患者的整合位点和整合频率的特点及与临床特征的关系。结果:1.HepG2.2.15细胞的整合位点成功检测出Hep G2.2.15细胞中,HBV-DNA在核基因组上的整合位点位于SHANK2（SH3 and multiple ankyrin repeat domains 2）基因。SHANK2基因位于11号染色体上,编码的蛋白质是突触蛋白Shank家族的一员。2.慢乙肝相关终末期肝病患者肝组织中HBV-DNA基因整合及临床特征本研究检测了8位慢乙肝相关终末期肝病患者肝组织中,HBV-DNA的整合情况。其中7位患者肝组织中有TBXAS1（thromboxane A synthase 1）整合,6位患者肝组织中有JAG2（jagged canonical Notch ligand 2）整合,4位患者肝组织中有MVK（mevalonate kinase）整合,3位患者肝组织中有TERT（telomerase reverse transcriptase）整合。HBV-DNA分别整合在3号染色体的ADCY5（adenylate cyclase5）、RP11-594G13,5号染色体的TERT、CTD-2345P7,12号染色体的MVK、HNRNPABP1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B pseudogene 1）,22号染色体的SYN2（synapsin II）、SC22CB,7号染色体的TBXAS1,10号染色体的HPSE2（heparanase 2）,11号染色体的SHANK2,13号染色体的RP11-594G13,14号染色体的JAG2（jagged canonical Notch ligand 2）,线粒体DNA的D-loop上。年龄50岁的患者整合位点数多的趋势（5.500±1.658 VS 2.000±0.0,p=0.079）;肝硬化失代偿期的患者整合位点数有比肝硬化代偿期的患者整合位点数多的趋势（2.000±0.0 VS 4.800±1.463,p=0.20）;年龄>50岁的患者的平均最大整合频率有比年龄50岁、是否是肝硬化失代偿期、以及肝癌的病理分型可能有关。尚需要进一步扩大样本量进行深入研究。