研究背景宫颈癌是一种威胁妇女生命健康的常见恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌而位居世界第二。由于发达国家癌前筛查的普及,近二十年来,宫颈癌的发病率明显降低；而在发展中国家,由于文化、经济因素的影响,癌前筛查并未完全普及。仅在我国,每年宫颈癌新发病例约15万例,其中大约2万女性死于宫颈癌。尽管目前研究发现,宫颈癌的预后与多种因素有关,但迄今为止还未有客观的预后指标。目前分子生物学研究已经确认,宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(HPV)的感染密切相关。人乳头瘤病毒(HPV)是一种无包膜的双链DNA病毒,现已发现100多种亚型,根据引起病变的良恶性程度可以分为低危型HPV和高危型HPV两类。低危型HPV病毒主要引起皮肤粘膜等组织的良性病变,而高危型HPV病毒的长期感染与宫颈癌的发生发展紧密相关。特别是HPV16、18型病毒,两者在宫颈癌组织中的阳性表达率高达60%。高危型HPV病毒的长期感染使病毒基因组片段整合到宿主细胞的基因组中,并且在整合状态下持续高表达病毒癌蛋白E6、E7。而E6、E7癌蛋白是参与细胞恶性转化的重要因素,它们可以分别抑制P53和降解pRb,通过改变宿主细胞内一系列分子信号通路并与之相互作用,最终使宿主细胞发生恶性转化。然而,仅有HPV E6、E7的过表达并不能介导宿主细胞的恶性转化,HPV感染只是宫颈癌发生的首要启动因子,HPV致宫颈癌的分子机制仍有待进一步阐明。蛋白磷酸酶2A(Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A)的癌性抑制因子(CIP2A)是2007年新发现的一种癌蛋白,它是PP2A的内源性抑制因子,可以通过PP2A抑制细胞内c-Myc蛋白S62位点的去磷酸化作用,从而稳定细胞内c-Myc蛋白的含量。现已证实,CIP2A在胃癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、乳腺癌中都高表达。这提示CIP2A在人类癌症的发生发展过程中扮演着重要角色,但其致癌机制尚不清楚。2011年,我们的前期研究发现：CIP2A在宫颈癌组织中高表达,CIP2A可以显著促进宫颈癌细胞的增殖、克隆形成和软琼脂克隆形成能力。且宫颈癌组织芯片中的免疫组化染色结果显示：HPV E7与CIP2A的表达之间存在显著相关性。然而,宫颈癌中HPV E7是否可以调控CIP2A?如果可以,它通过何种机制调控CIP2A? CIP2A及相关因子是否有望作为评估宫颈癌预后的独立因素?这些问题尚不清楚,也是本课题着力解决的科学问题。研究目的研究宫颈癌中HPV E7通过何种机制调控蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A),并进一步探讨基于此调控轴的相关蛋白对宫颈癌患者预后的指导意义。研究方法(1)利用小干扰RNA脂质体转染法敲低宫颈癌细胞HeLa、 SiHa中HPV E7的表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot的方法检测干扰E7后是否伴随CIP2A表达水平的下降；培养PHK及多种PHK-E7细胞,RT-qPCR及Western blot的方法对比其中CIP2A的表达水平,确认E7过表达是否伴随CIP2A表达的升高；确认E7与CIP2A的相互调控关系； (2)利用前期构建的野生型和突变型E7的PHK细胞,对比E7失去pRb结合位点后是否仍然具有调控CIP2A表达的能力,揭示E7是否通过pRb依赖性途径调控CIP2A;(3)通过大量的文献阅读和生物学软件预测,查找出CIP2A启动子区域可能被HPV E7调控的转录因子；运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa中筛选出最可能的转录因子X； (4)利用小干扰RNA及质粒过表达技术改变宫颈癌细胞HeLa、SiHa由HPV E7、CIP2A、转录因子X的表达,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot的方法检测三者在RNA水平和蛋白的差异性表达,揭示三者之间的相互调控关系；(5)利用免疫荧光技术检测在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa细胞中CIP2A和转录因子X的表达,激光共聚焦显微镜下观察两者是否存在亚细胞共定位；(6)利用前期制备的宫颈癌组织芯片免疫组化方法检测其中CIP2A和转录因子X的表达,显微镜下观察染色结果,SPSS软件进行统计学分析。通过卡方检验揭示两种蛋白的表达与患者临床病理参数的关系,通过KM生存分析、Cox单因素和多因素回归模型,阐明两种蛋白指导预后的价值。实验结果(1)干扰HeLa和SiHa细胞中HPV E7可以显著降低CIP2A的mRNA和蛋白水平的表达,而对比PHK-E7与PHK细胞发现,E7过表达后CIP2A的mRNA和蛋白表达水平显著上调,且高危型HPV E7对CIP2A的调控明显强于低危型E7。因此,HPV E7可以上调CIP2A的表达,且调控发生在转录水平。(2)当突变掉E7与pRb的结合位点,即E7失去了降解pRb蛋白的能力后,E7对CIP2A的调控作用显著降低,这提示E7对CIP2A的调控依赖于对pRb蛋白的降解；(3)通过大量的文献阅读和生物学软件预测,我们锁定了CIP2A启动子区域可能被HPVE7调控的转录因子：E2F1、ETS1、Elkl。运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa中筛选出了最可能的转录因子E2F1。(4)通过干扰和过表达技术,我们证实了宫颈癌细胞HeLa和SiHa中HPV E7通过转录因子E2F1上调CIP2A的转录和翻译,而CIP2A可以反馈性调控E2F1的转录和翻译,这提示E2F1和CIP2A之间存在相互调控的反馈环路,且调控发生在转录水平。(5)利用免疫荧光染色及激光共聚焦技术揭示了宫颈癌细胞系HeLa、SiHa细胞中CIP2A和E2F1存在显著的亚细胞共定位。(6)通过免疫组化染色及统计学分析,我们发现：E2F1和CIP2A的表达具有显著相关性；CIP2A和E2F1共表达的患者总体生存率和无病生存率显著下降,CIP2A和E2F1共表达可以作为独立的预后因子指导宫颈癌患者的预后。结论(1)宫颈癌中HPV E7通过pRb依赖性途径上调CIP2A的表达,E7通过转录因子E2F1上调CIP2A的表达,而CIP2A可以反馈性上调E2F1的表达。因此,宫颈癌中E2F1及CIP2A之间存在正反馈环路。(2)宫颈癌组织中E2F1及CIP2A存在显著的亚细胞共定位,两者的共表达是评估宫颈癌患者预后的独立因素。