Angiopoietin调控宫颈癌增殖侵袭及血管生成的研究

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[目的]血管紧张素及其受体主要特异性表达于血管内皮细胞。本课题组前期人宫颈组织免疫组化显示Ang1和Ang2及其受体Tie2在宫颈癌细胞中高表达,本实验旨在明确血管生成素对宫颈癌恶性生物学行为的影响。[方法]1.免疫细胞化学(ICC)染色和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测正常宫颈上皮细胞及宫颈癌细胞系Si Ha、Hela、C33A中Ang1、Ang2及Tie1、Tie2的表达。2.外源性人重组Ang1(rh Ang1)及Ang2(rh Ang2)用于上调Ang1、Ang2的水平;小干扰RNA(si Ang1和si Ang2)转染下调Hela细胞中Ang1、Ang2的表达。3.利用EDU细胞增殖实验、集落形成实验、Ki-67增殖实验检测经上述处理后宫颈癌细胞增殖能力的变化。4.利用划痕实验及Transwell迁移实验检测处理后宫颈癌细胞迁移能力的变化。5.利用Transwell侵袭实验检测处理后宫颈癌细胞侵袭能力的变化。6.动物实验(1)选取24只Balb/c裸鼠,皮下注射3×10~6 Hela细胞成瘤后随机分为4组,分别瘤内注射:(1)5%葡萄糖(溶剂对照组);(2)5%葡萄糖和in vivo-jet PEI(体内转染试剂对照组);(3)in vivo-jet PEI和si Ang1(si Ang1组);(4)in vivo-jet PEI和si Ang2(si Ang2组)。隔天测量移植瘤的径线长度(包括长、短径),根据长短径计算肿瘤的体积,利用体积数据绘成肿瘤的增长曲线。(2)免疫组织化学法检测四组移植瘤中Ang1、Ang2及波形蛋白(Vimentin)的表达情况。(3)免疫组织化学法-免疫荧光(IF)检测血管内皮黏蛋白Endomucin及平滑肌肌动蛋白α-SMA在各组移植瘤血管中的表达情况,评价血管数量及血管完整性。[结果]1.宫颈癌细胞中Ang1、Ang2及Tie1、Tie2在m RNA和蛋白水平的表达均明显高于正常宫颈上皮(P<0.01)。2.rh Ang1及rh Ang2刺激后,宫颈癌细胞的迁移及侵袭能力增强(P<0.05),而增殖能力无显著的改变。3.在Hela细胞中下调Ang1后,其迁移及侵袭能力均下降(P<0.05),下调Ang2后,细胞迁移能力下降,而细胞侵袭能力及增殖能力没有明显改变。4.动物实验:与对照组相比,si Ang1组及si Ang2组移植瘤的生长受到抑制(P<0.01);5.与对照组比较,si Ang1组和si Ang2组移植瘤组织中EMT途径的间质表型Vimentin表达水平降低,说明实验组肿瘤发生了间质向上皮的转化。6.与对照组比较,si Ang1组和si Ang2组移植瘤组织中新生的血管数量明显减少;但是肿瘤组织中的α-SMA的表达无明显改变。[结论]Ang1、Ang2能够促进宫颈癌的迁移侵袭,并促进肿瘤血管新生,从而推动疾病进展,并可作为宫颈癌的治疗靶点。
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