【摘 要】
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造血干细胞移植在临床血液病治疗,肿瘤放化疗病人恢复,以及一些遗传病的治疗等方面有着巨大的作用。由于其疗效在很大程度上取决于移植细胞的数量,而造血干细胞在体外却很难
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造血干细胞移植在临床血液病治疗,肿瘤放化疗病人恢复,以及一些遗传病的治疗等方面有着巨大的作用。由于其疗效在很大程度上取决于移植细胞的数量,而造血干细胞在体外却很难大量扩增,因此临床疗效的发挥受到很大限制。寻找更多的,有效的能够在体外扩增造血干细胞的细胞因子或可溶性配体是解决这一瓶颈问题的主要途径之一。我们在前期工作中成功地运用基因芯片分析方法,对5-氟尿嘧啶注射引起的小鼠骨髓抑制和再生过程第0天,第7天、第11天和第14天的基因表达差异进行了研究,除了获得已知与造血相关的重要细胞因子之外,我们还拿到了目前功能尚未知的12条分泌肽基因cDNA序列,编号为AK008108、BC052844、NM029537的基因是其中三条,这些基因的表达量在骨髓抑制和再生过程中表现出很明显的先上升后下降的现象,符合造血正调节细胞因子的特点。因而我们运用体内蛋白表达法这种简单快速的基因功能研究方法,对这些未知功能的基因进行筛选,以确定有造血作用的新基因。本研究从小鼠cDNA中钓出这三条未知基因的编码序列（CDS）,克隆入真核表达载体,通过小鼠肌肉细胞电转染技术实现这些基因在肌肉细胞过表达其编码的分泌型蛋白,进而观测基因产物对小鼠外周血、骨髓细胞数及骨髓组织形态变化的影响。本实验的主要方法及结论如下:收集小鼠5-Fu抑制期骨髓细胞,抽提总RNA,经RT-PCR得到小鼠基因组cDNA,通过PCR扩增基因AK008108,BC052844及NM029537的成熟肽编码序列。克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-）A MCS,测序正确后进行质粒大量制备并去除内毒素,测定内毒素含量不超过1EU/ug质粒。通过电转技术在肌肉细胞中表达基因产物,对正常小鼠及骨髓抑制小鼠进行药效学研究,观测到正常小鼠转染基因AK008108和BC052844后,实验组较对照组（pcDNA3.1转染）小鼠的骨髓细胞数和外周血白细胞数均显著增高,骨髓组织造血明显活跃,髓窦明显增多、腔隙增大,提示基因AK008108和BC052844可能促进骨髓造血。给转染基因AK008108和BC052844的小鼠注射细胞周期特异性化疗药物5-氟尿嘧啶后,外周血及骨髓细胞数的恢复均显著慢于对照组。正常小鼠转染NM029537基因后仅第17天外周血白细胞增高,而无相应的骨髓细胞形态和数量上的明显变化。这些结果提示基因AK008108和BC052844可能在骨髓再生过程中起正调控作用,为骨髓再生研究和治疗骨髓损伤提供新的思路。
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