牡丹(Paeonia sect. Moutan)是我国的传统名花,但传统的繁殖方法效率低下,操作过程繁琐,严重阻碍了产业发展的步伐。组织培养技术是解决牡丹繁殖难题的有效方法。经过半个世纪的研究,仍然没有形成能够在生产中应用的技术。分生结节培养是与体胚培养具有同等重要价值的体外再生方式,在大量难于离体培养的木本植物中实现了植株再生,是有望解决牡丹繁殖困难的新途径。本研究以叶柄薄层为外植体,从品种、植物生长调节剂(PGRs)等多种因素对愈伤组织诱导、分生结节诱导、增殖和分化的影响进行研究,同时对分生结节诱导、发生与发育过程进行了形态学和细胞组织学观察,初步实现了分生结节到不定芽和叶状体的分化,对最终在牡丹中建立高效的植株再生技术体系具有重要的参考价值。主要结论如下：1.愈伤组织是分生结节产生的前提。本研究表明愈伤组织的诱导受品种、外植体发育阶段和取材位置、PGRs浓度及其组合的显著影响。在供试的7个品种中,以’Golden Era’愈伤组织诱导率高、体积大且质地紧实；取材于开花期到花谢1周的外植体,经培养可以获得诱导率高,且褐化程度低的愈伤组织；近叶片和近基部的叶柄薄层外植体愈伤组织诱导率高,且很少发生褐化现象,而中部叶柄薄层外植体在培养过程中褐化现象非常严重；PGRs以1 mg/L的2,4二氯苯氧基乙酸(2,4-D)为参考,浓度过高会发生玻璃化和褐化现象,同时噻苯隆(TDZ)对愈伤组织形成具有促进作用,在’Golden Era’中经1 mg/L 2,4-D+1 mg/L TDZ处理,可得到诱导率高、体积大且质地紧实的愈伤组织。2.牡丹愈伤组织发生和发育的过程在外部形态上可划分为0-4五个级别,内部细胞组织学特征表现为经历了启动、分裂和形成三个时期。在启动期,外植体形成层细胞最先被活化,启动分裂过程；继而进入细胞旺盛增殖的分裂期,先后于外植体形成层和皮层薄壁细胞处产生了可见的愈伤组织,愈伤细胞体积小且细胞质浓；然后进入形成期,愈伤组织增殖速度减缓,只有接触培养基的周缘愈伤组织保持增殖。3.牡丹分生结节是从愈伤组织内部分化形成的。分生结节存在两种结构,一种是以维管单元为中心,外层由核大、细胞质浓的薄壁细胞构成,另一种是以特化的薄壁细胞为中心,外层由数层薄壁细胞包围形成。牡丹分生结节的形成受品种与取材位置、PGRs以及培养基中氮素存在形式和蔗糖浓度等多因素共同调节。本研究在’Golden Era’、’Bartzella’和’High Noon’品种中获得了分生结节,其中取材于中部叶柄薄层的诱导率略高于近叶片和近基部;经SH附加0.2 mg/L 2,4-D和6 mg/L 6-芐氮基腺嘌呤(BA)培养,’Golden Era’和’Bartzella’分别在培养基中含有N03-/NH4+比值为2.4和50 g/L蔗糖和N03-/NH4+比值为9.5和30g/L蔗糖时,分别获得了78.0%和55.6%分生结节诱导率。4.增殖是通过分生结节进行繁殖的重要环节。本研究表明荼乙酸(NAA)和TDZ对牡丹分生结节的增殖作用因品种不同。’Golden Era’培养于含有0.5mg/LNAA和1 mg/L TDZ,’Bartzella’于8 mg/L BA和5 mg/L TDZ的SH培养基上,分别获得83.3%和91.7%的分生结节增殖率。在液体悬浮培养条件下,分生结节主要以数量增殖为主,’Golden Era’的最佳液体培养周期为30天(d)。5.分化是通过分生结节进行繁殖的技术关键。本研究在’Golden Era’中通过两步培养法,初步实现了不定芽和叶状体的分化。第一步是在添加PGRs组合为0.25 mg/LNAA+0.5 mg/L TDZ或0.5 mg/L TDZ的SH培养基上,光照条件下培养45d后;第二步是转接到添加25g/L蔗糖+2g/L活性炭(AC)的SH培养基上培养,最终获得16%的不定芽和叶状体分化率。在此过程中,降低PGRs浓度和光照培养是影响分化的主要因素,此外,继代次数少、培养周期长的分生结节更容易分化。细胞组织学观察表明不定芽起源于分生结节表而,并与分生结节之间存在维管连接。