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目的:甲状腺激素对于人体细胞的正常发育和分化是必需的。甲状腺功能与生殖密切相关,甲状腺功能异常常引起生殖健康问题。HPG轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,下丘脑-垂体-性腺轴)的完整和功能正常是维持青春期发育与正常生殖功能的关键。KiSS1/KiSS1R系统是青春期发育启动的“gatekeepers(分子阀门)”,且是维持HPG功能的关键。下丘脑的GnRH(Gonadotropin-Releasing Hormone,促性腺激素释放激素)神经元及其上游Kisspeptin神经元中表达甲状腺激素受体。已有证据表明leptin-mTOR-Kisspeptin通路在生殖代谢调节中起了重要作用。本课题组之前的研究发现,脂联素能通过AMPK抑制GT1-7神经元细胞Sp1蛋白的转位并影响KiSS1基因的表达。因此,本研究的目的在于探讨T3(3,5,3’-triiodo-L-thyronine,3,5,3’-三碘-左旋-甲状腺原氨酸)是否可以通过mTOR信号调控Sp1蛋白的转位而参与KiSS1基因表达的调控。方法:1、本研究的第一部分主要探讨T3通过TR(thyroid hormone receptor,甲状腺激素受体)对KiSS1基因表达的调控是否发生在KiSS1基因的启动子水平。利用Western blot检测GT1-7细胞胞浆中是否表达甲状腺激素受体TRβ1蛋白;利用siRNA(Smal interference RNA,小干扰RNA)技术将TRβ沉默,用Weste rn blot检测T3是否通过TRβ调控Kisspeptin蛋白的表达;通过双荧光素酶报告基因检测系统分析T3干预不同的时间如何调控KiSS1基因的启动子活性,并结合siRNA技术沉默TRβ分析T3如何通过TRβ调控KiSS1基因的启动子活性。2、本研究的第二部分主要探讨PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/Akt-mTOR(The mammalian target of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素蛋白)信号通路是否参与T3对KiSS1基因表达的调控。我们在T3干预前预先用Wortman nin、LY294002(PI3K/Akt的抑制剂)和Rapamycin(mTOR的抑制剂)干预GT1-7细胞,利用Real-time PCR、Western blot、双荧光素酶报告基因系统分析了PI3K/Akt-mTOR信号通路是否可影响T3诱导的KiSS1基因的表达;利用Co-IP(C o-immunoprecipitation,免疫共沉淀)检测GT1-7细胞中胞浆TRβ1是否与PI3K的P85α调节亚基相互作用;利用ELISA检测T3对GT1-7细胞中PI3K活性的影响;利用Western blot检测T3对Akt和mTOR磷酸化的影响。3、本研究的第三部分主要探讨PI3K/Akt-mTOR信号通路参与T3对KiSS1基因表达的调控是否由Sp1介导。利用双荧光素酶报告基因检测系统分析T3对人类KiSS1基因全长启动子及多个缺失体活性的作用,进而判断出KiSS1基因启动子中的哪个区域是T3调控的关键序列,应用生物信息学网络在线分析该区域存在什么转录因子结合位点;基于上述的研究,我们构建Sp1基因表达重组载体,将其在GT1-7细胞中过表达,并结合Sp1蛋白的特异性抑制剂Mithramycin A的干预研究Sp1对T3诱导的KiS S1基因启动子活性的影响;我们还检测了T3和PI3K/Akt-mTOR信号通路对G T1-7细胞中Sp1亚细胞转位及其磷酸化修饰的作用;最后,我们用EMSA(electr ophoretic mobility shift assay,凝胶阻滞实验)和ChIP(Chromatin immunoprecipita tion assay,染色质免疫沉淀)技术检测Sp1是否与KiSS1基因启动子直接结合以及T3和PI3K/Akt-mTOR信号通路对Sp1蛋白与KiSS1基因启动子结合的影响。结果:1、GT1-7细胞胞浆表达甲状腺激素受体TRβ1蛋白;TRβsiRNA1259转染细胞会抑制T3诱导的Kisspeptin蛋白表达上调;200ng/ml T3干预细胞多个时间(24、48、72h)能够上调人类KiSS1基因启动子活性,以48h的作用最为明显,而TRβsiRNA1259转染会抑制该作用。2、Wortmannin、LY294002和Rapamycin的干预会抑制T3诱导的KiSS1基因mRNA和Kisspeptin蛋白表达上调,也能抑制T3诱导的KiSS1基因启动子活性;Co-IP证实GT1-7细胞中胞浆TRβ1与P85α亚基以不依赖于T3的方式相互作用,T3的干预能使PI3K的活性增加约74%,并快速增加Akt、mTOR的磷酸化,对mTOR的这种作用会被Wortmannin消除。3、启动子缺失分析表明T3诱导的KiSS1基因启动子活性依赖于启动子-191bp~-100b p序列中的Sp1结合位点;Sp1蛋白可以增强KiSS1基因启动子活性,Mithramyci n A可以抑制Sp1和T3诱导的KiSS1基因启动子活性;T3可以增加Sp1蛋白的核丰度,LY294002和Rapamycin会降低Sp1蛋白的核丰度,Sp1蛋白核丰度与S p1蛋白的丝氨酸磷酸化水平呈正相关;EMSA和ChIP技术证实Sp1蛋白可与人类KiSS1基因启动子-191bp~-100bp中潜在的Sp1位点直接结合,且T3可以增强Sp1蛋白与KiSS1基因启动子的结合,而rapamycin和LY294002则起到相反的作用。结论:1、T3通过TRβ调控KiSS1基因mRNA表达和Kisspeptin蛋白表达是通过其影响KiSS1基因启动子活性来实现的;2、PI3K/Akt-mTOR信号通路参与T3对KiSS1基因表达的调控;3、T3诱导KiSS1基因表达的上调是由PI3K/Akt-mTOR信号通路通过Sp1与KiSS1基因启动子中富含GC碱基的序列结合介导的;4、本研究为T3如何调控KiSS1基因表达提供了一个分子机制,对揭示甲状腺功能与生殖之间的关系有重要意义。