论文部分内容阅读
吸入麻醉药包括七氟醚在内可能对发育期大脑的结构和功能有不利影响。本研究探究了七氟醚引起发育期大鼠记忆损伤可能的分子机制和其海马区神经元形态结构改变。目的探究在体和离体情况下七氟醚暴露新生大鼠后引起的树突棘改变、空间工作记忆障碍及α7nAChR和NMDAR表达水平在以上变化中的作用,以及探究SFK是否为α7nAChR调节NMDA受体的中间媒介。方法1.雄性健康SD大鼠,160只,鼠龄7天,体重10~15 g,随机分为4组(每组大鼠n=40):对照组(C组),吸入30%氧气6 h;3%七氟醚麻醉组(S组),吸入3%七氟醚+30%氧气6 h;α7nAChR激动剂PNU-282987组+3%七氟醚(PS组),腹腔注射PNU-282987(5 mg/kg)后吸入3%七氟醚+30%氧气6 h;和α7nAChR拮抗剂MLA组(M组),腹腔注射MLA(3 mg/kg)后吸入30%氧气6 h。各组大鼠饲养至2月鼠龄,采用Western blot检测大鼠海马区α7nACh R表达水平及膜蛋白和总蛋白含NR1、NR2A和NR2B亚基的NMDA受体表达水平,免疫荧光方法观察NMDA受体在大鼠海马CA1区神经元的分布情况。采用Y迷宫实验测试空间记忆能力,采用高尔基体染色法测定四组大鼠海马CA1区辐射层神经元树突棘密度和树突棘长度。2.健康雄性SD大鼠64只,鼠龄7天,体重10~15 g,随机分为4组(每组大鼠n=16):对照组(C组),3%七氟醚麻醉组(S组),α7nAChR激动剂PNU-282987组(P组)和α7nAChR拮抗剂MLA组(M组)。麻醉各组大鼠,处死大鼠后立即取大脑,大脑即刻放入0℃脑脊液中冷却孵育。制备大脑切片(180μm)。C组脑片不作处理,置入人工脑脊液中孵育;S组置入人工脑脊液中孵育同时暴露于3%七氟醚环境中6 h;P组,脑片置入含有PNU(终浓度为500nmol/L)的人工脑脊液中孵育;M组,将脑片置入含有MLA(终浓度为10nmol/L)的人工脑脊液中孵育。各组脑片孵育6 h后,应用western blot检测各组SFK及膜蛋白和总蛋白含NR1、NR2A和NR2B亚基的NMDA受体表达水平,高尔基体染色法测定各组海马CA1区辐射层神经元树突棘密度和树突棘长度。3.健康雄性SD大鼠24只,鼠龄7天,体重10~15 g,随机分为3组(每组大鼠n=8):对照组(C组);α7nAChR激动剂PNU-282987组(P组);α7nAChR激动剂PNU-282987+Src家族酪氨酸激酶(SFK)抑制剂PP2组(PP组),脑片置入含有PNU(终浓度为500nmol/L)+PP2(终浓度为104 nmol/L)的人工脑脊液中孵育。各组孵育6 h后,应用western blot检测各组膜蛋白和总蛋白含NR2B亚基的NMDA受体表达水平。结果1.在体情况下,与C组比较,S组和M组2月鼠龄大鼠海马区CA1区辐射层树突棘密度和长度均减少(P<0.01);Y迷宫测试中,S组和M组2月鼠龄大鼠自发交替百分率较对照组降低(P<0.01);S组大鼠海马区α7nAChR表达水平及膜蛋白含NR1、NR2A及NR2B亚基的NMDA受体表达水平均降低(P<0.01);M组α7nAChR表达水平及膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体表达水平均减少(P<0.01);膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体向膜转运减少(P<0.01)。与S组比较,PS组大鼠海马区CA1区辐射层树突棘密度和长度均增加(P<0.01);Y迷宫测试中,PS组2月鼠龄大鼠自发交替百分率增加(P<0.01);Western Blot中,PS组大鼠海马区α7nAChR表达水平及膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体表达水平均增加(P<0.01);免疫荧光染色中,PS组大鼠海马CA1区膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体向膜转运增加(P<0.01)。2.在离体情况下,与C组比较,S组和M组大鼠海马区CA1区辐射层神经元树突棘密度和长度均减少(P<0.01);而P组大鼠海马区CA1区辐射层神经元树突棘密度和长度均增加(P<0.01)。Western Blot中,与C组比较,S组大鼠海马区SFK表达水平及膜蛋白含NR1、NR2A及NR2B亚基的NMDA受体表达水平均降低(P<0.01);而P组大鼠海马区SFK及膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体表达水平均增加(P<0.01),M组大鼠海马区SFK及膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体表达水平均降低(P<0.01)。与P组比较,PP组大鼠海马区膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体表达水平降低(P<0.01)。结论七氟醚暴露幼鼠后可引起其海马区神经元密度和形态改变,损伤其长期学习记忆能力。在体和离体情况下,α7nAChR被激活后可逆转七氟醚暴露幼鼠引起的树突棘减少和空间记忆损伤,减弱七氟醚对膜蛋白含NR2B亚基的NMDA受体的下调作用。并且α7nAChR可通过SFK调控NR2B亚基的NMDA受体的表达,该变化可能参与了七氟醚暴露新生大鼠引起海马神经元树突棘形态改变和空间工作记忆损伤的机制。