研究背景：结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤,发病率、死亡率均居全球第三位,分别占全球每年新发病例、癌症相关死亡原因的9%。过去的几十年内,人们的膳食结构发生了明显变化。曾经由于物质匮乏,人们的饮食以粗粮为主。现在随着经济的快速发展及居民生活水平的不断提高,人们已趋向于富含动物蛋白、脂肪及缺乏纤维素的饮食模式。研究表明,这种饮食模式可能会使人体内产生过多的甲基蒽类物质,后者可增加结直肠癌的发病率。在我国,结直肠癌的发病率亦呈逐年升高趋势,其死亡率在所有肿瘤相关死亡中居于第五位。近年来,尽管在肿瘤的预防、治疗方面取得了长足进展,但其发病率、死亡率仍居高不下。其中不可控制的侵袭和转移是患者死亡的主要原因,包括肝、肺、淋巴结、腹膜转移等。侵袭、转移是结直肠癌发生发展中一个重要的、有序的、非随机的、具有器官选择性的、多步骤的、多基因协同参与的过程。目前与结直肠癌侵袭转移相关的基因研究主要包括：基质金属蛋白酶家族、尿激酶型纤溶酶原激活物系统、细胞粘附分子家族、趋化因子超家族等。由于其发生发展过程的复杂性,其具体作用机制尚未完全明确,因此加强结肠癌侵袭、转移相关分子机制方面的研究已成为结肠癌研究中的重点和热点,其研究成果可作为临床肿瘤治疗新的突破点,对结直肠癌的治疗、预后判断均有一定的临床指导意义。趋化因子超家族由趋化因子配体及其相应的趋化因子受体构成。趋化因子是指能够吸引白细胞、淋巴细胞移行到感染部位的一些低分子量(通常多为8-10KD)的蛋白质,可与细胞外的G蛋白偶联受体相结合,从而介导细胞的迁移、趋化,在炎症反应中发挥重要作用。根据其N端的前2个半胱氨酸之间是否插入其他氨基酸及插入氨基酸的数目,将它们分为CXC、CC、CX3C和C四个亚型。其中,CXCL12还被命名为基质细胞衍生因子,亦被称为前B细胞刺激因子。因其对淋巴细胞有强烈的趋化作用,在多种器官(如骨髓、淋巴结、肺、脑、肝脏、心脏、肾脏)的上皮细胞及多种肿瘤细胞中均有表达,是目前研究较多的一种趋化因子。趋化因子受体是一高度保守的、与G蛋白偶联的7次跨膜受体,与其相应的配体具有高亲和性。目前为止,已被发现的趋化因子受体至少有20个,根据其氨基酸端的前2个半胱氨酸之间是否插入其他氨基酸,同样将它们分为四个亚型,分别为：CXCR、CCR、CX3CR和CR。最初发现,趋化因子及其相应的受体结合后可介导感染、炎症等过程。然而,近些年来,研究者已证实两者相结合后可激活下游的信号级联活动,介导信号传导等病理生理过程,在肿瘤的发生发展、侵袭转移中亦发挥着重要作用。据研究表明,CXCL12/CXCR4生物轴在多种恶性肿瘤的侵袭转移、肿瘤相关血管生成等多种病理生理过程中发挥着重要作用。随着对趋化因子CXCL12相应受体研究的不断深入,发现CXCR4并非是CXCL12唯一的受体。趋化因子受体7 (Chemokine receptor 7, CXCR7)最初是从狗的甲状腺cDNA库中克隆产生的,被认为是趋化因子的孤儿受体。后因其结构与趋化因子受体CXCR亚家族的结构相似,与CXCR4有31%的同源性,且与CXCL12具有很高的亲和性,故被重新命名为CXCR7,被确认为CXCL12的第二受体。CXCR7作为一个与细胞膜相关的受体,较少表达于正常的细胞,但可在激活的血管内皮细胞、脑源性神经元细胞、树突状细胞及胚肝细胞等细胞中呈高表达状态。CXCR7作为CXCL12的新的受体,目前围绕这一受体在肿瘤领域的研究开展较少。现有实验表明CXCL12/CXCR7生物轴在细胞增殖、肿瘤相关血管生成中有与CXCR4类似的生物效应。CXCR7在乳腺癌、前列腺癌及肺癌中高表达能增加肿瘤细胞的侵袭转移能力,但其具体作用机制仍需进一步研究。最近的研究表明,CXCR7蛋白在多种恶性肿瘤中呈高表达状态,其高表达可能在肿瘤的侵袭、转移等演变过程中扮演着重要角色,如促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡及提高肿瘤微血管的密度等。CXCR7在肺癌、膀胱癌、浸润性乳腺癌、恶性黑色素瘤等多种肿瘤中呈高表达状态,其高表达与肿瘤的组织学分级、远处转移、淋巴结转移、TNM分期及患者的生存预后密切相关。另一方面,CXCR7在转移性直肠癌中高表达,其表达上调与肿瘤的生长、恶性程度相关。CXCR7的表达水平越高,肿瘤的恶性程度就越高。研究人员利用RNA干扰技术,将CXCR7的siRNA片段转染至结肠癌细胞SW116中,发现SW116细胞中CXCR7的表达被抑制,细胞的侵袭转移能力显著下降。我们推测CXCR7可能在促进结直肠癌的侵袭、转移中发挥着重要作用。现有的临床研究表明CXCR7的高水平表达是宫颈癌、肺癌患者无病生存期的独立预测因子。然而,关于CXCR7在结直肠癌中的表达情况及其与临床病理特征、患者生存预后的关系的研究,国内外尚未见相关报道。目的：本研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)、免疫印迹实验(Western Blot)分别检测CXCR7mRNA、CXCR7蛋白在结直肠癌肿瘤组织及癌旁组织中的表达水平。运用免疫组织化学染色法(Envision法)检测CXCR7蛋白在结直肠癌肿瘤组织、癌旁组织中的表达,分析其表达水平与结直肠癌患者临床特征及生存预后的关系。本研究可能为结直肠癌的早期诊断、疾病进程的监测及生存预后的评估提供新的方向,并为结直肠癌分子靶向药物的开发带来新的突破。材料：本研究所用的结直肠癌新鲜组织标本均取自在江苏省南京市南京军区南京总医院普通外科行手术切除并经病理确诊的结直肠癌患者,在肿瘤根治术后切取结直肠肿瘤组织及相对应的癌旁正常组织20对,取得新鲜组织后立即置于液氮中冰冻,并储存于-80℃冰箱。收集南京军区南京总医院病理科存档的结直肠癌石蜡组织标本及相对应的癌旁正常组织标本96对,所有免疫组化染色的片子均由两位以上病理科专家双盲阅片诊断。肿瘤分期以国际抗癌联盟(International Union Against Cancer, UICC)为标准。所有患者术前均未行放化疗及其他治疗,术后辅以常规化疗(XELOX/FOLFOX方案)。患者的临床资料由医院的诊疗系统及电话随访获得,随访时间从术后开始直至患者死亡或本研究截止日期(2014年9月)。本研究开始前所有患者均已签署知情同意书,并获得了金陵医院伦理委员会的批准。方法：1.实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)1.1引物的设计及合成在GenBank中查找人类CXCR7和β-actin基因的mRNA序列,并由上海英俊生物技术有限公司合成。1.2实时荧光定量PCR (RT-PCR)用Trizol法提取结直肠癌肿瘤组织、癌旁组织的总RNA。然后,按照逆转录试剂盒的要求,将RNA逆转录为cDNA,反应条件为：25℃10分钟,42℃15分钟,85℃5分钟,1个循环。逆转录完成后,将cDNA置于-80℃冰箱内保存备用。实时荧光定量PCR运用SYBR(?)Green I嵌合荧光法,反应条件为：95℃,15s,变形；60℃,1分钟,退火；72℃,30s,延伸,45个循环。2.免疫印迹实验(Western Blot)提取结直肠癌肿瘤组织、癌旁正常组织中的总蛋白,用BCA法测定蛋白的浓度,100℃10分钟变性后冰上冷却,-80℃分装保存。经SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、转膜后,加入CXCR7鼠单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA),4℃摇床孵育过夜。次日,用1×TBST漂洗(3次,5分钟／次),然后滴加辣氧根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(Sigma, USA),室温下摇床孵育2小时,1×TBST漂洗(4次,每次10分钟)。暗室内发光显影,用Image-J软件定量分析,检测CXCR7蛋白的表达水平。3.免疫组织化学染色法(Envision法)所有手术切除的组织标本均经10%中性福尔马林溶液固定,选取癌组织、癌旁正常组织进行常规石蜡包埋,连续切片切成4um的组织切片,置于多聚赖氨酸涂胶片上。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,柠檬酸盐缓冲液高压高温抗原热修复,3%H202封闭内源性过氧化酶,加入工作浓度为8ug/mL的CXCR7鼠单克隆抗体(IgGl, MAB-42273, R&D Systems, Inc., minneapolis, MN 55413 USA),4℃孵育过夜。次日,经37℃复温后,用PBS缓冲液(pH 7.2)对着切片冲洗三次。擦干切片后,滴加DAB进行显色,镜下观察,当染色完成时终止显色反应。最后经苏木精衬染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片。免疫组化染色后的病理切片均由两位以上有经验的、高年资的、对临床资料不知情的病理科专家共同阅片。随机选取10个有代表性的视野,结合CXCR7阳性染色细胞的百分比及染色强度的分级,采取半定量的方法进行评分。阳性细胞百分比评分标准如下：小于5%细胞染色阳性为0分,5%至10%细胞阳性染色为1分,10%至50%细胞染色阳性为2分,50%至75%细胞阳性染色为3分,大于75%细胞染色阳性为4分。染色强度分级的评分标准如下：无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。最后将阳性细胞百分比的评分与染色强度分级的评分相乘,两者的乘积就是最后得分：总分小于2被视为CXCR7阴性表达,大于等于2被视为CXCR7阳性表达。4.统计学分析本研究运用SPSS19.0软件进行统计分析。计数资料用均数(x)±标准差(s)的形式表示,并采用单因素的方差分析(one-way ANO VA)来比较。实时荧光定量PCR (RT-PCR)数据用2-ΔΔCt公式进行处理：CXCR7基因表达量和β-actin基因表达量的相对比值用Ct值计算,CXCR7 mRNA在结直肠癌组织、癌旁组织中表达水平差异的倍数可通过2-Δ△Ct计算,运用两个独立样本的t检验分析这两组数据间的差异。采用x2检验分析CXCR7在结直肠癌、癌旁正常组织中的表达差异及其表达水平与临床病理特征之间的关系。采用Kaplan-Meier法分析CXCR7蛋白表达与患者生存时间的关系,并用log-rank检验比较生存曲线的差异。同时运用Cox回归模型分析各临床病理特征对患者生存预后的影响。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果：使用RT-PCR、Western Blot分别检测20对结直肠癌新鲜组织标本中CXCR7 mRNA、CXCR7蛋白的表达水平,结果显示CXCR7 mRNA/CXCR7蛋白在结直肠癌组织中的表达均明显高于癌旁正常组织(P<0.01),差异具有统计学意义。对96例结直肠癌切片进行免疫组织化学染色,结果显示：CXCR7在结直肠癌组织、癌旁正常组织中的阳性表达率分别为：64.6%(62/96)、20.8%(20/96),CXCR7蛋白在结直肠癌肿瘤组织中的染色比例显著高于癌旁非肿瘤组织(P<0.001)。CXCR7蛋白主要表达于结直肠癌细胞的细胞质及肿瘤相关血管细胞的细胞质内,呈棕黄色颗粒状,而在正常的肠黏膜组织中却不表达或很少表达。CXCR7在结直肠癌组织中的阳性表达与发生淋巴结转移(P<0.001)、远处转移(P=0.017)和TNM分期高(P<0.001)显著相关,却未发现与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、肿瘤大小及分化程度存在显著相关关系。CXCR7阳性表达组、阴性表达组患者的5年总生存率(5-year Overall Survival,OS)分别为30.2%、79.4%,CXCR7阳性表达组患者的OS显著低于CXCR7阴性表达组(P<0.001),差异具有统计学意义。同样地,CXCR7阳性表达组、阴性表达组患者的5年无进展生存率(5-year progression free survival, PFS)分别为21.9%、61.8%, CXCR7阳性表达组患者的PFS显著低于CXCR7阴性表达组(P<0.001)。CXCR7阳性表达组的患者较CXCR7阴性表达组的患者预后不良。多因素Cox回归模型显示,CXCR7阳性表达是影响总生存率(HR:4.426,95% CI: 1.554-12.604, P= 0.005)、无进展生存率(HR:2.700,95% CI:1.275-5.717, P= 0.009)的独立预后因素。结论：CXCR7 mRNA在结直肠癌组织、癌旁组织中的表达水平呈逐渐递减的趋势。结直肠癌癌组织中CXCR7蛋白的表达显著高于相对应的癌旁正常组织。CXCR7表达水平的上调可能参与了结直肠癌肿瘤的发生发展,并提示着结直肠癌患者不良的生存预后。