【摘 要】
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H9N2亚型禽流感（Avian influenza,AI）是由A型禽流感病毒引起的,以禽类发病为主的一种人畜共患传染病。该病感染率和死亡率都偏低,但会引起肉鸡生长缓慢、蛋鸡产蛋下降、呼吸困难等危害,同时还有可能跟其他病原微生物引发共感染,严重影响我国禽类养殖业的发展。疫苗接种是预防和控制H9N2亚型AIV最为直接也是最为有效的手段。当前国内H9N2亚型AIV疫苗的生产主要以鸡胚基质培养为主,随着我
【基金项目】
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山东省自然科学基金【ZR2021MC096】； 国家现代农业产业技术体系资助【CARS-41-Z10】； 山东省农业科学院农业科技创新工程【CXGC2021B03】和【CXGC2018E10】；
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H9N2亚型禽流感（Avian influenza,AI）是由A型禽流感病毒引起的,以禽类发病为主的一种人畜共患传染病。该病感染率和死亡率都偏低,但会引起肉鸡生长缓慢、蛋鸡产蛋下降、呼吸困难等危害,同时还有可能跟其他病原微生物引发共感染,严重影响我国禽类养殖业的发展。疫苗接种是预防和控制H9N2亚型AIV最为直接也是最为有效的手段。当前国内H9N2亚型AIV疫苗的生产主要以鸡胚基质培养为主,随着我国禽类养殖市场需求的不断扩大,鸡胚基质流感疫苗暴露出很多缺陷和不足,急需一套经济又高效的疫苗生产技术。近年来,细胞基质培养逐渐走进人们的视线,因为其拥有更加严格的操作环境和标准的制备技术以及易于规模化培养,这对禽流感大爆发时鸡胚疫苗供应不足提供了解决办法。因此,细胞基质生产禽流感疫苗在未来有着巨大的发展潜力。本研究首先选取了12株2016～2020年实验室分离鉴定的H9N2亚型AIV,分析每个毒株的TCID50和EID50,比较它们在MDCK细胞和鸡胚中的增殖能力,结合前期本实验室对这些毒株进行的抗原性分析结果,确定选取CK/SD/3424/16作为本研究中细胞基质疫苗株的候选株。进一步对此毒株在MDCK细胞上复制效果条件进行优化,结果发现该毒株的接毒量为0.001 MOI,TPCK-treated胰酶终浓度为4μg/m L,收获病毒最佳时间为感染后48 h。成功优化了CK/SD/3424/16在MDCK细胞上的增殖条件。本研究选取的12株H9N2亚型AIV在不同基质的培养下病毒复制存在较大的差异性。为探究H9N2 AIV细胞基质培养的限制性因素主要影响流感病毒复制周期的哪个阶段,本研究进一步选取了在MDCK细胞中复制差异的两株模式病毒:CK/SD/3424/16和CK/SD/3426/16。通过荧光定量PCR和Western Blot初步分析两株病毒感染细胞后不同时间点病毒蛋白的转录和表达情况,推断这两株病毒在复制的早期阶段即存在较大差异。进一步研究流感病毒的侵入阶段,通过流式细胞术检测结果表明两株病毒对细胞的吸附能力基本一致,通过WB检测结果表明两株病毒感染细胞后内吞水平基本一致。通过NP蛋白免疫荧光染色观察结果表明CK/SD/3426/16的NP入核数目相较于CK/SD/3424/16明显偏少。通过双荧光素酶实验结果表明两株病毒的聚合酶活性存在较大差异,并且除PB2蛋白外的三种蛋白都是引起聚合酶差异的关键因素。以上结果表明:造成CK/SD/3424/16和CK/SD/3426/16在MDCK细胞中感染增殖差异的因素主要是在病毒感染的侵入和转录阶段,CK/SD/3424/16株病毒具有更强的入核和转录能力。基于以上研究获得的MDCK细胞基质高产株CK/SD/3424/16,本研究进一步优化H9N2亚型AIV疫苗毒株的纯化方法,将收获的CK/SD/3424/16病毒液通过超滤管进行浓缩,并利用复合介质Capto Core 700进行纯化,制备成油乳剂疫苗。通过动物实验评价细胞基质流感疫苗与鸡胚基质流感疫苗的免疫原性差异,进一步利用质谱鉴定和比较分析两种基质培养的H9N2亚型AIV各病毒蛋白修饰差异。动物实验结果表明:采用MDCK细胞为基质生产的流感疫苗与鸡胚基质流感疫苗相比,免疫原性和保护效果均更好;质谱鉴定结果表明:细胞基质培养的H9N2亚型AIV病毒蛋白在Y401位发生了磷酸化修饰,分子量增加了79.966324。综上所述,本研究成功筛选并优化了H9N2亚型AIV细胞基质疫苗株的候选株,比较了其与鸡胚基质疫苗的免疫差异,为细胞基质流感疫苗的开发与应用奠定了理论基础。确定了造成不同禽流感毒株在MDCK细胞上增殖差异的原因,为H9N2亚型AIV细胞高产株和病毒株的改造和修饰提供了新的位点。鉴定了H9N2亚型AIV病毒HA蛋白的磷酸化修饰位点,为阐明不同基质流感疫苗的免疫原性差异提供了新的研究视角。
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