背景血型是指以血液抗原形式表现出来的、以红细胞表面是否存在某些抗原物质为分类依据的一种遗传性状。目前已发现并且为国际输血协会(International Society of Blood Transfusion, ISBT)承认的血型系统有30种,如ABO、Rh, MNS及P血型系统等,而最为重要的是ABO和Rh(恒河猴因子)血型系统。ABO血型系统是由卡尔·兰德施泰纳(Karl Landsteiner)发现的人类最早认识的血型系统。根据红细胞膜表面是否含有A或B凝集原,ABO血型系统分为A型、B型、AB型及O型。Rh血型系统是人类最具多态性的血型系统,它含有的抗原数目不少于45个,临床关系最密切的抗原有5种：D、E、C、c、e,这5种抗原中D的抗原性最强,对临床更为重要。根据人的红细胞上是否存在D抗原,Rh血型系统分为Rh阳性(Rh+)和Rh阴性(Rh-)。输血作为有效的治疗手段已广泛应用于临床,全球每年输入患者体内的血液约为8500万单位。然而输血也存在一定风险,若输入的血液与患者不相容,可能出现急性溶血反应,引起休克和肾功能衰竭,甚至死亡。输血前若未行ABO血型相容性检测,约1/3的患者可能会出现溶血反应。因此,快速和准确的ABO/Rh血型检测对需要输注血液的患者尤为重要。献血者和受血者ABO/Rh血型的正确鉴定是确保输血安全必不可少的前提条件。ABO/Rh血型检测方法的基本原理是红细胞抗原与血清抗体的凝集反应。血型的分类取决于红细胞膜上是否有相应的抗原。根据兰德施泰纳定律,红细胞膜上含有某抗原(如A、B或D抗原)时,其血清中一定不含相应的抗体；反之,若红细胞表面缺乏某抗原,则血清中一定存在相应的抗体。临床常用的ABO/Rh血型检测方法有玻片法、试管法和微柱凝胶法等。以上方法准确、客观,具有高度的敏感性和特异性,但仍有不足之处：(1)需专业人员操作；(2)需特定的实验仪器；(3)需适宜的实验条件；(4)反应时间较长；(5)需要的血量较多；(6)样本需要前处理。因此,传统的血型检测方法虽能满足临床及实验室的需求,但不能满足战地环境、重大自然灾害等特殊情况的血型检测。常见的特殊情况有：(1)战争。同既往战争相比,空间、纵深、突然性加大的现代战争具有高损毁、高速度、高消耗、全方位、全战法等特点。显著变化的军事环境使战地救护呈现战场不固定、抢救环境险恶、救治场所缺乏、短时间伤亡救治量大等新特点。战地抢救的新特点要求卫生装备具有更高的快速反应能力和便携机动能力。军事卫生装备需满足以下特点：a体积小、重量轻；b操作简单；b结果准确可靠；c肉眼可直接读出结果；d无需外接电源或其它实验室设备；e机动性强,易于携带。(2)严重的自然灾害。地震、石流、海啸等突发的自然灾害具有不可预测性,且破坏力极大。医疗资源不足、基础医学设备缺乏、医护人员短缺是伤员抢救的主要障碍。(3)经济条件落后、地理位置偏僻的不发达国家或地区。这些国家或地区的人们无法承担发达国家那样高昂的医疗费用,他们只能接受价格便宜的基础医疗措施。但受经济制约,基础的医疗设备、专业的医疗人员均短缺。按照世界卫生组织的要求,不发达国家的医疗设备需满足"ASSURED"要求,即：Affordable(价格便宜,可随受)、Sensitive(高敏感性)、Specific(高特异性)、User-friendly(便于操作)、Rapid and robust(快速、稳定)、Equipment free and Deliverable to end-users(无需外接设备,易于携带)。因此,价格便宜、简便快捷、易于携带、结果直观、易于判读的即时检验(point of care test, POCT)方法对特殊情况的血型检测至关重要。作为21世纪医学检验新的发展方向,POCT已得到了越来越广泛的关注。它的主要特点是“快、边、便、易”,即：在传统实验室外,由非检验专业人员用最简单而经济的方法在最短的时间内得到准确的结果。美国临床生化科学院(American Academy of Clinical Biochemistry, NACB)在其制定的"POCT特证文件”的草案中,将POCT定义为“在接近病人治疗处,由未接受临床实验室多科训练的临床人员或者病人(自我检测)进行的临床实验室检验”。为了实现血型即时检测的目的,人们进行了许多尝试。中国专利申请200320121646.2(公开号2669196)、03215617.0(公开号为2605574)、200920222236.4(公开号CN201522495U)公开了一种简便的ABO血型鉴定卡；中国专利ZL200620112928.X(公开号为2901313)公开了一种ABO血型反定型试剂盒。以上专利描述的血型检测方法操作简便,易于携带,结果准确可靠,但仍有不足之处：(1)只能检测ABO血型,不能实现ABO血型和Rh血型的同时检测；(2)不能直接读出血型检测结果,不利于非专业人员报告结果。基于以上不足,本课题拟研究一种适用于战地等特殊情况使用的便携式ABO/Rh血型检测方法,新方法需达到以下要求：1.能同步检测ABO/Rh血型；2.体积小、重量轻,易于携带；3.无需外接电源或其它实验室设备；4.结果准确可靠,具有较高的敏感性和特异性；5.操作方法简单,结果易于判断,即使非专业人员也可使用。滤纸是实验室常用的过滤工具,由于其特有的优点,越来越多科研人员开始的利用滤纸研制便携式医疗设备。滤纸的优点主要有：(1)价格便宜,随处可见；(2)可生物降解,易于处理；(3)轻便,易于携带；(4)由纤维组成,其内的小孔具毛细作用,不需要借助外界能量。毛细作用又称毛细现象,是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象。薄层分析、蒸腾作用、毛巾吸汗、纸张吸水都是常见的毛细现象。滤纸的材质是纤维制成品,因此它的表面有无数的小孔,起着毛细管的作用。由于滤纸的这些优点,我们选用滤纸作为研究对象,研究一种适用于战地等特殊情况的便携式ABO/Rh血型检测方法,为进一步开发出战地便携式ABO/Rh血型检测卡(或片)打下基础。第一章以滤纸为介质的毛细作用观察[目的]观察滤纸毛细现象,为下一步以基于滤纸为介质的ABO/Rh血型检测的研究提供实验依据。[方法]1.不同类型滤纸的毛细现象观察：(1)准备6种不同的国内、外定性滤纸：快速定性滤纸(101),中速定性滤纸(102),慢速定性滤纸(103),华特门2号滤纸,华特门3号滤纸,华特门4号滤纸；(2)将滤纸裁成3cm×16cm的滤纸条;(3)往200ml容积的烧杯内加2cm深的0.9%氯化钠注射液及2滴红色墨水；(4)将滤纸条垂直置于烧杯内并观察烧杯内滤纸的变化；(5)10分钟后取出滤纸条,直尺测量并记录滤纸被液体浸润的长度；(6)重复操作步骤4和5各20次。2.以滤纸为介质的毛细作用对抗凝血的影响2.1毛细作用对未滴加血型抗体的抗凝血的影响：(1)收集20例EDTA抗凝血；(2)准备6种不同的国内、外定性滤纸：快速定性滤纸(101),中速定性滤纸(102),慢速定性滤纸(103),华特门2号滤纸,华特门3号滤纸,华特门4号滤纸；(3)将滤纸裁成3cm×16cm的滤纸条,每种滤纸各20条；(4)距滤纸下缘2cm的中点处,分别加l0ul相同标本抗凝血于6种滤纸条；(5)滤纸条垂直立于盛有生理盐水的烧杯内侧壁,10分钟后取出滤纸,观察实验现象；(6)直尺测量并记录滤纸被抗凝血浸润的长度。2.2毛细作用对滴加血型抗体后的抗凝血的影响：(1)收集20例EDTA抗凝血(A+Rh+4例,A+Rh-1例,B+Rh+、AB+Rh+、0+Rh+各5例)；(2)将华特门4号滤纸裁成5cm×16cm的滤纸条；(3)每例血在同一滤纸上,距下缘2cm处,于左侧(抗A)、中侧(抗B)、右侧(抗D)中点处分别滴加l0ul抗凝血；(4)在滤纸对应处,各加l0ul抗A、抗B、抗D单克隆抗体溶液；(5)将滤纸垂直置于盛有生理盐水的烧杯内,10分钟后取出滤纸,观察实验现象,数码相机拍照。2.3凝集和非凝集的浸润长度及光密度检测：(1)选取60例(A型、B型血各30例)EDTA抗凝血,按2.2所述的方法检测每例标本的ABO血型;(2)直尺测量并记录各抗凝血顶点至红色浸润带顶端的距离为凝集和非凝集的浸润长度；(3)数码相机拍照并用Image-Pro Plus6.0软件分析凝集和非凝集浸润的平均密度和累积密度。软件的具体操作步骤如下：①Image-Pro Plus6.0软件打开需要分析的图片；②光密度单位的转换：measure-calibration-intensity,调出intensity校正窗口,点new按钮,再点std. opt density选项,这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线,随后点最上面的system按钮,最后点close关闭窗口；③选定AOI：点击上方的Irregular AOI工具,出现magic wand对话框,点击trace按钮,选定需分析的区域,单击右键确定；④AOI转换成测量区域：选择工具栏measure-count/size-edit convert AOI to objects;⑤选择测量项目：选择工具栏measure-count/size-measure-select measures,点击对话框左侧的density(mean)和IOD,然后点measure按钮,最后点“OK”;⑥查看分析结果：选择工具栏measure-count/s i ze-measurement data,弹出的窗口中查看平均密度和累积密度；(4)SPSS13.0软件分析数据。[结果]1不同类型滤纸的毛细现象观察：6种滤纸均可见毛细现象。由于毛细作用,烧杯内的生理盐水沿着滤纸向上浸润,最后在滤纸上形成红色浸润带。各滤纸被液体浸润的长度不等。华特门4号滤纸最长(151.55±5.21,mm),慢速定性滤纸最短(80.1±4.82)。三种华特门滤纸浸润长度差异具统计学意义(F=374.61,P<0.01),国内三种滤纸浸润长度差异具统计学意义(F=180.56,P<0.05),六种滤纸浸润长度总体差异具统计学意义(F=394.865, P<0.05)。LSD法两两比较条带长度,华特门3号滤纸与国内中速滤纸上条带长度的差异无统计学意义(P=0.2),其余任何两组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。2以滤纸为介质的毛细作用对抗凝血的影响2.1毛细作用对未滴加血型抗体的抗凝血的影响：未加血型抗体的抗凝血随生理盐水沿着滤纸向上浸润,最后在滤纸上形成红色浸润带。不同类型滤纸上的红色浸润带长度不等。华特门4号滤纸最长(50.9±5.20,mm),慢速定性滤纸最短(3.35±1.42)。三种华特门滤纸浸润长度差异具统计学意义(F=916.03,P<0.01),国内三种滤纸浸润长度差异具统计学意义(F=326.12,P<0.05),六种滤纸浸润长度总体差异具统计学意义(F=684.26,P<0.01)。LSD法比较两两比较红色浸润带长度,华特门3号滤纸与国内中速滤纸上条带长度的差异无统计学意义(P=0.55),其余任何两组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。2.2毛细作用对滴加血型抗体后的抗凝血的影响：滤纸上可见两种不同的实验现象：①非凝集血液随着生理盐水沿滤纸向上浸润,抗原抗体反应区颜色变淡,滤纸上形成红色浸润带；②凝集血液不随着生理盐水沿滤纸向上浸润,反应区颜色不变,滤纸上无红色浸润带。2.3凝集和非凝集的浸润长度及光密度检测：(1)60份血液的实验现象均与前面的研究结果(2.2)一致：凝集血(滴加A型血的滤纸左侧与滴加B型血的滤纸右侧)的颜色不变,无红色浸润带；非凝集血(滴加A型血的滤纸右侧与滴加B型血的滤纸左侧)的颜色变淡,有红色浸润带。(2)凝集血红色浸润带长度为(0.26±0.44)mm,非凝集血红色条侧长度为(49.32±4.78)mm,两侧条带的差异具统计学意义(p<0.01);凝集血平均密度(0.60±0.06)与非凝集血平均密度(0.41±0.04)的差异具统计学意义(p<0.01);凝集血累积密度(39779.23±6437.36)与非凝集血累积密度(23556.38±3593.99)的差异具统计学意义(p<0.01)。[结论]6种滤纸均有毛细现象,华特门4号滤纸毛细作用最强,慢速定性滤纸的毛细作用最弱。在滤纸的毛细作用影响下,血型抗原抗体反应区呈现两种不同的现象。非凝集血反应区的颜色变淡,滤纸上形成红色浸润带；凝集血反应区的颜色不变,滤纸上无红色浸润带。以滤纸为介质的毛细作用能够实现ABO/Rh血型鉴定。第二章以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测的影响因素[目的]分析滤纸类型、抗体类型、反应时间及抗原抗体比值对以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测结果的影响。[方法]1抗原抗体比值对检测结果的影响：(1)准备50例已知血型的抗凝血(A型、B型各25例)；(2)用华特门4号滤纸和国内抗体检测各标本的血型(具体操作方法见第一章2.2),每例标本各测3次,每次滴加的标准血清：待测血分别为10ul:5ul (2:1),10ul:10ul (1:1),10ul:20ul (1:2);(3)10min后直尺测量并记录红色浸润带长度;(4)spssl3.0统计软件分析数据。2滤纸类型对检测结果的影响：(1)准备50例已知血型的抗凝静脉血(A型、B型各25例)；(2)每例标本均分别用以下滤纸各检测一次：快速定性滤纸(101)、中速定性滤纸(102)、慢速定性滤纸(103)、华特门2号滤纸、华特门3号滤纸、华特门4号滤纸(国内抗体,标准血清：血液=1：1)；(3)10min后测量并记录红色浸润带长度；(4)spssl3.0统计软件分析数据。3不同抗体对检测结果的影响：(1)准备50例已知血型的抗凝静脉血(A型、B型各25例)；(2)每例标本均分别用国内抗体和国外抗体各检测一次(华特门4号滤纸,标准血清：血液=1：1))；(3)10min后测量红色浸润带长度；(4)spssl3.0统计软件分析数据。4反应时间对检测结果的影响：(1)准备50例已知血型的抗凝静脉血(A型、B型各25例);(2)用华特门4号滤纸检测每例标本的血型(国内抗体,标准血清：血液=1：1))；(3)每隔1分钟测量并记录滤纸上红色浸润带的长度,直到第10分钟后取出滤纸条；(4)spssl3.0统计软件分析数据。[结果]1抗原抗体比值对检测结果的影响：三种血清/血液比值之间的凝集红色浸润带长度差异无统计学意义(P=0.88);三种血清/血液比值之间的非凝集红色浸润带长度差异无统计学意义(p=0.64);每种血清/血液比值的凝集与非凝集之间的红色浸润带的差异均具统计学意义(p<0.01)2滤纸类型对检测结果的影响：6种滤纸检测后,其凝集与非凝集红色浸润带长度的差异均具统计学意义(p<0.01);6种滤纸非凝集红色浸润带的长度差异具统计学意义(p<0.01),华特门4号滤纸非凝集红色浸润带最长(49.64±4.6,mm),国内慢速定性滤纸非凝集红色浸润带最短(2.02±1.56)。3不同抗体对检测结果的影响：国内、外两种抗体分别检测后,其凝集与非凝集条带长度的差异均有统计学意义(p<0.01);国内、外抗体非凝集红色浸润带长度差异无统计学意义(p=0.56);国内、外抗体凝集红色浸润带长度差异无统计学意义(p=0.77)。4反应时间对检测结果的影响：非凝集从第1分钟开始出现红色浸润带(5.08±1.28,mm),第3分钟时,红色浸润带平均长度超过了20mm(22.66±2.64,mm)。此后红色浸润带长度随反应时间的延长而延长,各时间段红色浸润带长度差异有统计学意义(p<0.01)。[结论]抗原抗体比值及抗体类型对检测结果无影响；非凝集红色浸润带的长度与滤纸类型和反应时间有关。第三章以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法的优化与临床验证[目的]对以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法进行优化及临床验证。[方法]1以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法的优化：(1)准备6cm×16cm的华特门4号滤纸条并在其右上角标上患者的姓名；(2)距滤纸下缘4cm的左侧(抗A)、中间(抗B)、右侧(抗D)处,分别用红色特种铅笔写上字符“A”、“B”、“+”；(3)距字符正下方约2cm处,用l0ul医用PE塑料滴管分别加1管待测抗静脉血。(4)用l0ul医用PE塑料滴管分别加1管抗A、抗B、抗D标准血清于左侧、中间、右侧的抗凝血上；(5)将滤纸条垂直置于盛有生理盐水的烧杯内；(6)l0min后,取出滤纸,判断血型。2以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法临床论证：(1)随机抽取400例未知血型的抗凝静脉血；(2)一人独立用玻片法检测并记录400例标本的血型,具体的操作步骤如下：①取清洁玻片一块,左、中、右侧分别标记为抗A、抗B、抗D；②在相应玻片处的中央处分别滴加标准抗A、抗B、抗D血清1滴;③用吸管吸取待测血,分别各滴1滴于左、中、右侧抗体上,注意勿使吸管与血清相接触；④用吸管混匀血液,使之与血清充分接触;⑤观察并记录结果。肉眼观察有无凝集反应,如果见到红色点状或小片状凝集块,为阳性。肉眼不易辨别时,则为可疑结果,需进一步验证;(3)另一人独立用优化后的滤纸检测方法检测相同的400例标本的血型(具体步骤见本章优化部分)；(4)对比玻片法和滤纸法的检测结果。[结果]1以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法的优化：非凝集血上方的红色字符被红色浸润带遮住,凝集血上方的红色字符仍清晰可见。可以根据滤纸上的红色字符直接读出血型检测结果。2以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法的临床验证：两种方法对400例标本的ABO/Rh血型检测结果完全一致(A型110例,B型114例,AB型49例,0型127例；Rh阳性400例,Rh阳性0例)。[结论]优化后的ABO/Rh血型检测方法操作简便快捷,结果直观准确,有利于本检测方法在环境恶劣的战地现场的应用。以滤纸为介质的ABO/Rh血型检测方法具有与传统血型鉴定方法相同的敏感性、特异性和准确性。