沙门菌是感染人和温血动物的重要病原菌。部分沙门菌血清型能感染不同的宿主（泛宿主性沙门菌）,常见的有肠炎沙门菌（S.Enteritidis下文简称SE）、鼠伤寒沙门菌等;另一部分的沙门菌血清型则特异性地感染一种或少数几种宿主（宿主特异性沙门菌）,例如鸡白痢沙门菌（S.Pullorum下文简称SP）、伤寒沙门菌、都柏林沙门菌等。与泛宿主性沙门菌不同,宿主特异性沙门菌往往会引起宿主急性的全身性感染,这可能与其感染过程中不同于泛宿主性沙门菌所引起的免疫应答有关。SP和SE两种血清型的沙门菌具有较近的遗传关系,可是却表现出非常不同的致病特征和宿主感染谱。SP只感染禽类动物,幼雏感染后往往引起急性的全身性感染,并伴随有高死亡率,幸存下来的动物则常伴有Th2型免疫应答下的长期持续感染。SE是典型的泛宿主性沙门菌,主要引起急性肠胃炎,并刺激宿主产生Th1型免疫应答。目前对于沙门菌中造成禽类动物在感染SE和SP时表现出截然不同的免疫应答类型的关键影响因子的认识尚知之甚少。测序技术的快速发展极大地促进了测序数据的积累。这些数据包含有大量的生物学信息,如何根据特定的研究目的高效地识别和提取研究者关心的信息已成为当务之急。SP和SE核心基因组之间的差异是重要的信息来源,分析这些差异数据将有助于识别导致两种血清型表型差异的相关因子。本研究分析了 SP和SE之间核心基因组的差异,并开发了新的生物信息学工具,用以帮助研究人员高效地识别和挖掘细菌基因组与其表型之间的联系。通过联合应用生物信息学分析、分子细菌学技术以及细胞感染模型,发掘和鉴定了 SP中影响其感染禽源巨噬细胞免疫应答特征的关键因子。研究很好地结合了生物信息学数据分析方法及传统微生物学实验分析策略,体现了多学科交叉融合在推进沙门菌关键功能因子研究中的优势,也为其它病原菌的研究提供了思路和范例。1.鸡白痢沙门菌与肠炎沙门菌核心基因组差异分析第一章主要分析了 97株SP和47株SE的核心基因组差异。我们在对两种血清型沙门菌的基因组比较中,鉴定出145和127个分别属于SP和SE所独有的核心编码序列。两种血清型所独有的编码序列都表现出染色体位置富集上的偏向性,即许多独有的基因往往聚集形成连续的基因簇。这一结果也印证了前期研究,即染色体上大片段DNA的插入是沙门菌血清型遗传进化的重要特征之一。毒力及耐药基因注释结果显示在这些独有序列中有一大部分基因位于毒力岛（Pathogenicity island,PAI）上,这也符合SP和SE在感染过程中的毒力差异表征,表明这些元件可能是引起两种血清型毒力差异的重要成因。SP独有编码序列的遗传物质来源分析显示相当比例的SP独有序列来源于质粒,这意味着质粒在SP特殊表型中发挥了重要作用。在分析核心编码序列差异的基础上,我们进一步分析了 SP和SE共有的核心编码序列及其上游100 bp片段内的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）,鉴定了保守地存在于SP和SE之间的SNP,并将存在于核心编码序列内的保守性SNP称为core-SNP,存在与核心编码序列起始密码子上游100 bp内的保守性SNP称为CuSNP。在分析的3997个核心编码序列中,1791个（44.81%）基因含有core-SNP,443个（11.08%）基因的起始密码子上游含有CuSNP。我们通过系统性地分析具有或不具有core-SNP/CuSNP相关核心编码序列的分布特征及生物学功能,获得了许多有价值的生物学信息,为筛选可能影响病原菌致病机制及相关功能因子提供了重要的线索和数据支持。例如,Ⅳ型分泌系统（Type Ⅳ secretion system,T4SS）是一个多功能的细菌分泌系统,能够在细菌接合转移中促进质粒的转移;本研究结果显示编码该系统的基因簇中含有较高比例的core-SNP和CuSNP,提示SP和SE的T4SS功能可能存在较大的差异。此外,SNP分析结果显示沙门菌发挥致病力的重要毒力元件,Ⅲ型分泌系统效应蛋白（Type Ⅲ secretion systems effector,T3SE）在SP和SE间存在较高比例的CuSNP突变。特别是基因pipA、sifA、sptP和ygbK,它们在编码序列和起始密码子上游区域都包含保守性的SNP位点。所有的分析步骤都编译在一个名为“Corevar”的新建立的生物信息学分析管线内,该分析管线也适用于其它细菌,可用于识别用户自定义的细菌种群间的基因组差异。2.蛋白表征相似性分析工具Duo的开发及应用在第一章中,我们鉴定了许多潜在的可能造成SP和SE之间致病力差异的关键靶标。为进一步提高筛选效率,寻找造成两种血清型致病力差异的关键靶标,第二章中我们重点开发了一款名为“Duo”的生物信息学分析工具。Duo可以批量且高效地识别蛋白质的生物学功能表征,并依据这些表征将查询和参考序列之间的具有相似生物学表征的条目进行关联。因此,工具的一个实用功能是能够根据用户内建的具有特定性状或功能表征的参考蛋白质序列组来预测查询蛋白质序列组中具有相似表征的目标序列。为了验证该工具在预测特定性状蛋白质序列中的优良表现,我们开展了基于Duo工具预测鼠伤寒沙门菌全基因组中毒力因子的案例测试,并通过评价不同输入数据对这一筛选案例结果的影响,为用户提供了“输入数据”的制备建议。软件通用性测试中我们成功地对来自32个不同种属的病原菌的全基因组进行了类似的毒力基因预测。所有结果都验证了 Duo能够高效地帮助用户预测感兴趣的目标序列,是一个有价值的生物信息学分析工具。3.鸡白痢沙门菌中调控巨噬细胞免疫应答的关键因子筛选和鉴定在第三章中,我们开发了一个定制化的生物信息学分析管线来对第一章中鉴定的具有CuSNP的编码序列进行筛选,提取其中可能对SP感染引起宿主免疫应答有影响的关键因子,进而重点探究这些因子在SP感染宿主后引起Th2型免疫应答中的作用。我们将Duo成功地应用于识别可能引起SP持续感染的关键因子。这些筛选的CuSNP和相关基因与第一章中鉴定的SP所独有的并包含毒力相关基因的DNA片段一起,将作为重点靶标进行深入研究。依据这些选定的靶标,研究设计和构建了相关的SP突变株,并评价了突变株在感染禽巨噬细胞HD11中的感染潜力及其刺激细胞因子分泌的能力。缺失了 SP独有的几个DNA大片段的突变株,ΔT6SS、Δ6kb和Δ10kb,在感染巨噬细胞后表现出和野生株相似的侵袭和胞内定殖能力,同时感染引起的相关细胞因子表达水平也与未突变的野生株感染组相似。这些结果表明,在SP中保守存在而在SE中缺失的DNA片段可能对其诱导不同于SE的免疫应答并不是必需的。研究也发现缺失了大部分Ⅵ型分泌系统（Type Ⅵ secretion system,T6SS）核心蛋白编码序列的ΔT6SS引起了感染后的巨噬细胞分泌更多的iNOS,这表明T6SS下调了这种反应。SP中T6SS的功能是否在其感染过程发挥重要作用仍有待进一步研究。另一方面,与野生型SP感染巨噬细胞相比,一些感染了缺失CuSNP相关基因突变株的巨噬细胞表现出了明显的不同于同期野生组诱导下的炎性相关细胞因子的表达水平。这些基因包括sseE、osmB、tolQ以及一个预测为编码免疫抗原的基因（group5437）和一个预测为编码持续感染相关的基因（group6178）,以上结果提示这些基因上游的CuSNP有可能参与或调节了细菌感染过程中的免疫应答。此外,我们还比较了 SP和SE中8个具有CuSNP的T3SE基因在细菌感染巨噬细胞期间的基因表达差异。结果显示pipA、sifA和sopB基因的表达水平在两种血清型间存在显著差异。据此,本研究在SP中构建了 2株分别按照SE中sifA和pipA基因对应的上游CuSNP碱基类型的点突变株。SP中“校正”了pipA上游CuSNP的点突变株相较于野生株,其pipA基因的表达量显著升高,并且感染的巨噬细胞会激发更强的促炎因子上调表达（感染后2h）。这表明SP中pipA基因相关的CuSNP通过下调PipA的表达抑制感染早期炎症反应。