研究目的： 建立过氧化氢诱导乳鼠小脑颗粒神经元凋亡模型，研究熊去氧胆酸对小脑颗粒神经元凋亡是否具有保护作用，并进一步探讨其可能的信号转导机制。 研究方法： 大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养，并建立过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元模型；以神经元存活率、细胞形态学、DNA凋亡梯带等为指标评价过氧化氢对小脑颗粒神经元的凋亡性损伤作用，并观察给予熊去氧胆酸预处理24小时后上述各指标的变化。蛋白免疫印迹法(Western blotting，WB)分别检测CREB、p-CREB、Caspase-3蛋白水平变化，JNK/c-Jun通路蛋白以及它们各自的磷酸化形式的水平；逆转录-聚合酶链式反应(reverse。transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)观察c-Jun基因mRNA水平的表达。探讨熊去氧胆酸抗神经元凋亡作用是否和上述蛋白的表达改变有关。 结果： 我在实验中发现，UDCA对过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元凋亡有明显的抑制作用，进而从信号转导的角度探讨了CREB、JNK/c-Juni通路及caspses-3在UDCA抑制小脑颗粒神经元凋亡中的作用。 1.MTT结果显示，过氧化氢对小脑颗粒神经元的损伤具有时间和剂量依赖性，随着剂量的增加和作用时间的延长，神经元的凋亡率增加。其中，过氧化氢100μM、冲击30分钟的作用模式最适合作为过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型。UDCA预处理可减少过氧化氢引起的神经元凋亡，提高细胞存活率。 2.从DNA凝胶电泳结果可看出，100μM、冲击式作用30分钟后再培养12小时，过氧化氢可诱导神经元凋亡梯带的出现，1001μM UDCA预处理24小时能够抑制过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元的凋亡。 3.通过观察细胞形态学改变、Hochest33258染色进一步验证，100μM UDCA预处理24小时能够明显抑制过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元核固缩、碎裂。 4.WB结果显示，过氧化氢100μM、冲击30分钟后培养12小时内，p-CREB的表达逐渐减少；Caspase-3的蛋白表达不变；在JNK/c-Jun通路中，p-c-Jun和c-Jun在过氧化氢冲击后5分钟开始升高，1小时左右达到最高。UDCA预处理可以明显抑制H<,2>O<,2>刺激所引起的p-CREB减少，还可以抑制c-Jun和p-c-Jun表达的升高。对于c-Jun上游的p-JNK1/2、p-ERK1/2、p-P38的进一步WB检测中发现，p-ERK1/2、p-P38的表达无明显变化，而p-JNK1/2在过氧化氢100μM、冲击30分钟后5分钟就达到峰值。UDCA预处理可以抑制p-JNK1/2蛋白表达的升高，说明UDCA可以通过抑制JNK1/2的活化进而抑制c-Jun的磷酸化。 5.RT-PCR结果显示，过氧化氢刺激使c-Jun的mRNA表达水平增高，而UDCA预处理可以抑制此增高。 结论： 1.适当的过氧化氢刺激可以在体外成功诱导出小脑颗粒神经元的凋亡模型。凋亡的产生与p-CREB的降低，以及p-c-Jun的升高有关。 2.100μM熊去氧胆酸预处理24小时可以对过氧化氢诱导的神经元凋亡具有明显保护作用。 3.熊去氧胆酸对过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用与升高p-CREB水平有关。 4.熊去氧胆酸对过氧化氢诱导的小脑颗粒神经元凋亡的抑制性保护作用是通过抑制p-c-Jun水平的升高来实现的。也即通过抑制氧化应激过程中c-Jun基因的表达及抑制p-JNK对c-Jun的激活两个方面来实现。