目的:本文以20-50岁健康同卵双胞胎、异卵双胞胎和非双胞胎为研究对象,分析同卵、异卵双胞胎和非双胞胎之间外周血TCRβ链假基因CDR3受体库(Pseudogene CDR3 repertoires)、框架外重排CDR3受体库(Out of frame rearrangement CDR3repertoires)与功能性CDR3受体库(Productive CDR3 repertoires)的同质性和异质性,以及同卵双胞胎、异卵双胞胎和非双胞胎之间TCRβCDR3受体库前后5年的动态变化,初步探讨个体遗传因素对V(D)J重组过程中的偏向性影响和TCR的MHC-自身肽耐受的选择效应,为进一步研究TCR的重排和选择的机制和应用等提供基础。方法:1.采集6对健康双胞胎志愿者(D、e、F、G、h、i)外周血各10ml,分离PBMCs并提取总DNA;设计并合成30条人TRBV基因家族特异性上游引物,14条人TRBJ基因家族特异性下游引物,以总DNA为模板多重PCR扩增TCRβCDR3受体库,胶回收PCR产物送华大基因,完成质检和质控后,采用Illumina Solexa高通量技术对各样本的TCRβCDR3受体库进行测序。2.2012年和2017年分别采集3对健康双胞胎志愿者(A、B、c)的外周血各10ml(2012年的采集由课题组完成),分离PBMCs并提取总DNA,分别送至Adaptive Biotechnologies immune SEQ公司(美国华盛顿医院)和华大基因,采用多重PCR技术,构建TCRβCDR3受体库,采用Illumina Solexa高通量技术对各样本的TCRβCDR3受体库进行测序。3.将9对双胞胎样本的DNA送北京博奥晶典生物技术有限公司,采用PCR-SBT方法对HLA-A/B/C/DRB1位点进行分型检测。4.TCRβCDR3受体库特征对比分析:(1)对比分析同卵双胞胎(D1/D2,F1/F2,G1/G2)、异卵双胞胎(e1/e2,h1/h2,i1/i2)和非双胞胎(D1/e1,D1/F1,D1/G1,D1/h1,D1/i1)的假基因CDR3、框架外重排CDR3和功能性CDR3受体库中各序列组成的同质性和异质性;(2)对比分析同卵双胞胎(A1/A2,B1/B2)、异卵双胞胎(c1/c2)和非双胞胎(A1/B1,A1/c1,A1/c2,B1/c1,B1/c2)前后5年TCRβCDR3受体库的动态变化。结果:1.双胞胎HLA定型结果显示:A,B,D,F,G为同卵双胞胎,c,e,h,i为异卵双胞胎。2.TCRβCDR3受体库多样性分析:(1)同卵、异卵、非双胞胎之间的多样性无统计学差异。(2)功能性CDR3受体库前后5年的多样性无统计学差异。3.TCRβCDR3受体库TRBV/TRBJ基因取用:(1)假基因CDR3序列中,同卵双胞胎的TRBV/TRBJ基因取用更相似,同卵、异卵、非双胞胎三组之间差异显著;TRBV基因取用前后5年动态变化在同卵双胞胎之间更一致。(2)框架外重排CDR3序列中,同卵和异卵双胞胎的TRBV/TRBJ基因取用相似,与非双胞胎差异显著;前后5年动态变化在同卵、异卵和非双胞胎之间无显著差异。(3)功能性CDR3序列中,相对于假基因CDR3序列,同卵双胞胎的TRBV/TRBJ基因取用相似度减小,同卵、异卵、非双胞胎三组之间差异减小;TRBV/TRBJ前后5年动态变化在同卵、异卵、非双胞胎之间无显著差异。(4)假基因CDR3序列中,同卵双胞胎的TRBV/TRBJ基因取用的相似性显著高于框架外重排CDR3序列和功能性CDR3序列。4.TCRβCDR3受体库V-J配对:(1)假基因CDR3序列中,同卵双胞胎的V-J配对分布最相似,前后5年的动态变化在同卵双胞胎之间更一致。(2)框架外重排CDR3序列中,部分同卵双胞胎的V-J配对相似,前后5年的动态变化在同卵双胞胎之间更一致。(3)功能性CDR3序列中,同卵、异卵、非双胞胎的V-J配对随机分布,前后5年的动态变化在同卵、异卵、非双胞胎之间无显著差异。5.TCRβCDR3受体库AA取用与长度分布:同卵、异卵、非双胞胎之间的CDR3区的AA取用、CDR3区的AA长度分布无显著差异,前后5年动态变化无显著差异。6.TCRβCDR3受体库AA的Overlap:(1)同卵、异卵、非双胞胎之间的重叠(Overlap)无统计学差异;而功能性高频分段AA序列中,部分同卵和异卵双胞胎的重叠比例高于不相关个体。(2)CDR3重叠序列前后5年的动态变化在同卵、异卵、非双胞胎之间无显著差异。7.TCRβCDR3受体库核苷酸的插入与删除:(1)假基因CDR3序列中,插入和删除不同核苷酸数目的比例相似性:同卵双胞胎>异卵双胞胎>非双胞胎;前后5年动态变化在同卵双胞胎之间更一致。(2)框架外重排CDR3序列中,同卵、异卵、非双胞胎之间插入不同核苷酸数目的比例相似;前后5年动态变化在同卵双胞胎之间更一致。(3)功能性CDR3序列中,同卵、异卵、非双胞胎之间插入不同核苷酸数目的比例相似;前后5年动态变化在同卵、异卵、非双胞胎之间无显著差异。结论:1.在TCRβ链假基因CDR3序列中,和非双胞胎(D1/e1,D1/F1,D1/G1,D1/h1,D1/i1)比较,同卵双胞胎(D1/D2,F1/F2,G1/G2)和异卵双胞胎(e1/e2,h1/h2,i1/i2)的V/J基因取用,V-J配对,核苷酸的插入和删除等表现出较多的同质性,并且在功能性高频分段AA序列中,部分同卵和异卵双胞胎的重叠比例高于不相关个体。提示个体遗传因素对V(D)J初始重组和胸腺中MHC-自身肽的耐受选择存在偏向性,并影响到外周血总T细胞β链CDR3受体库的组成特征。2.在TCRβ链假基因CDR3序列和TCRβ链框架外重排CDR3序列中,TCRβ链CDR3受体库的V基因取用,V-J配对,核苷酸的插入和删除前后5年的动态变化在同卵双胞胎(A1/A2,B1/B2)之间更为一致,在异卵双胞胎(c1/c2)和非双胞胎(A1/B1,A1/c1,A1/c2,B1/c1,B1/c2)之间不一致。结果进一步提示遗传因素可能对外周血总T细胞CDR3受体库的偏向性产生影响。