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目的研究叶酸(folate)对胚胎、新生Sprague-Dawley (SD)大鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的增殖和分化作用影响,并探讨其机制。方法采用孕14d～16d SD胚胎鼠,以及24h以内的同窝新生鼠全脑,进行NSCs原代培养。在正常培养条件下分为4组：①正常对照组(Normal control);②叶酸缺乏组(Folate-D)培养液中给予甲氨蝶呤剂量为0.4μg/ml;③低剂量叶酸组(Folate-L)培养液中给予叶酸剂量为4μg/ml;④高剂量叶酸组(Folate-H)为叶酸40μg/ml。在缺氧培养条件下分为5组：①正常对照组(Normal control);②缺氧模型组(Hypoxia);③缺氧叶酸缺乏组(Hypoxia+Folate-D)给予甲氨蝶呤为0.4μg/ml;④缺氧低剂量叶酸组(Hypoxia+Folate-L)给予叶酸剂量为4μg/ml;⑤缺氧高剂量叶酸组(Hypoxia+Folate-H)给予叶酸剂量为40μg/ml。首先收集应用无血清培养基培养的增殖6d的部分细胞,然后将剩余的NSCs细胞加血清使之分化,继续培养6d,收集分化的神经细胞。此外,缺氧培养条件下,首先将NSCs增殖3d,然后建立缺氧模型,再复氧24h,最后收集全部增殖期NSCs。1.采用克隆、酶切与测序等方法对RT-PCR产物进行鉴定。2.采用实时定量SYBR Green I-PCR方法,测定NSCs Notch信号通路相关基因(Hes1、Hes5)以及MAPK信号通路相关基因(ERK1、ERK2)mRNA表达情况。3.采用Western blot方法,检测正常培养条件下胚胎鼠增殖／分化期NSCs pERK1、pERK2蛋白表达含量。结果1.普通RT-PCR扩增产物经克隆、酶切、测序显示,特异性好,扩增片段与预期结果相符。2. SYBR Green I-PCR结果显示,在正常培养条件下：①增殖6d,叶酸增加胚胎鼠、新生鼠NSCs Hes1、Hes5 mRNA的表达(P<0.05),但叶酸高低剂量组之间差别无统计学意义(P>0.05)。分化6d,叶酸降低胚胎鼠、新生鼠NSCs Hes1、Hes5 mRNA的表达(P<0.05)。②增殖6d,补充叶酸对胚胎鼠、新生鼠NSCs ERK1、ERK2 mRNA的表达无影响,但Folate-D组低于其他各组(P<0.05)。分化6d,除Folate-H对胚胎鼠ERK2 mRNA表达高于其他各组(P<0.05)外,补充叶酸对胚胎鼠、新生鼠NSCs ERK1、ERK2 mRNA的表达无影响。3. SYBR Green I-PCR结果显示,在缺氧培养条件下：①补充叶酸能增加胚胎鼠增殖期缺氧各组Hes1、Hes5mRNA表达(P<0.05)；叶酸对增殖期新生鼠NSCs Hes1 mRNA的表达无影响(P>0.05),叶酸能增加增殖期新生鼠NSCs Hes5 mRNA的表达(P<0.05)。②叶酸对增殖期胚胎鼠、新生鼠NSCs ERK1、ERK2 mRNA的表达无影响(P>0.05)。4. Western blot对正常培养条件下胚胎鼠NSCs增殖／分化期中pERK1、pERK2蛋白表达进行检测结果。增殖6d,叶酸能增加胚胎鼠NSCs pERK1、pERK2蛋白表达。分化6d,叶酸对胚胎鼠NSCs pERK1、pERK2蛋白表达无影响。结论1.在正常培养条件下,叶酸可能通过上调增殖期胚胎鼠、新生鼠NSCs Notch信号通路中Hes1、Hes5基因mRNA的表达促进NSCs增殖；通过下调分化期胚胎鼠、新生鼠NSCs Hes、Hes5基因mRNA的表达而促进NSCs分化。2.在正常培养条件下,无论在增殖期还是分化期,叶酸对胚胎鼠、新生鼠NSCs Hes1、Hes5基因mRNA表达的调控作用趋势基本一致,但是有一定差异性。3.在缺氧培养条件下,叶酸对胚胎鼠、新生鼠增殖期Notch和MAPK信号通路中相关基因mRNA和蛋白的表达趋势与正常培养条件下的表达趋势基本一致。叶酸可能通过调节基因mRNA的改变,改善缺氧对NSCs所造成的损害。4.在正常培养条件下与缺氧培养条件下,叶酸对增殖、分化期胚胎鼠／新生鼠的NSCs MAPK信号通路中ERK1、ERK2基因mRNA的调节作用不明显。5.叶酸能够调节增殖期胚胎鼠NSCs MAPK通路中pERK1、pERK2蛋白表达量,促进NSCs增殖；叶酸对分化期胚胎鼠NSCs pERK1、pERK2蛋白表达量无影响。6.无论在正常培养条件下还是缺氧培养条件下,叶酸40μg/ml剂量组与4μg/ml剂量组对胚胎鼠、新生鼠NSCs的增殖、分化中Notch和MAPK通路中相关基因及蛋白的调节作用基本一致。因此,叶酸可能通过影响Notch和MAPK信号通路中相关基因mRNA的表达,进而影响各基因翻译,从而促进NSCs的增殖、分化,对神经系统损伤和神经退行性疾病起到一定的防治作用。