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DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dc)与组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)是两种表观修饰剂,在体细胞克隆中用于对供体细胞或胚胎进行重编程,参与DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、染色质重塑等过程,使核移植胚的表观重编程更充分,提高体细胞克隆效率；低浓度的TSA处理孤雌胚能够促进胚胎的发育能力,但这两种抑制剂在牛孤雄胚中的作用尚未见报道。本研究利用TSA与5-aza-dc分别处理牛孤雄胚,观察这两种抑制剂对牛孤雄胚早期体外发育的作用；同时优化这两种抑制剂的处理条件(处理浓度、处理时间及处理阶段)；在此基础上,检测TSA处理后组蛋白H3的乙酰化水平及参与表观重编程的基因的相对表达量,进一步分析TSA对牛孤雄胚体外发育的作用机制,研究结果如下：1.TSA对早期牛孤雄胚体外发育的作用培养液中添加浓度为0(对照)、5、10、15、20和50nmol/L的TSA,在重构胚激活后培养孤雄胚15h,然后用未添加TSA的培养液继续培养,分析TSA对孤雄胚体外发育的作用及其与浓度的关系。结果发现,在培养液中添加TSA有利于孤雄胚的发育,最适浓度为5nmol/L,表现为卵裂率(80.6%)、16-细胞期胚胎率(46.8%)、桑椹胚率(29.0%)及囊胚率(12.9%)最高(P<0.05)。用含TSA 10 nmol/L的培养液在重构胚激活后培养孤雄胚0、10、15、20和25h,比较TSA作用时间对孤雄胚体外发育的影响。结果发现,培养15h和20h的胚胎卵裂率、16-细胞期胚胎率和囊胚率均显著高于对照组(P<0.05)。说明TSA作用15h或20h对牛孤雄胚的早期体外发育效果最佳,而作用时间不足或过长均不利于牛孤雄胚的早期体外发育。在TSA处理过程中设计三个处理时期,即休整期(激活前2h开始处理)、激活期(激活开始处理)与培养期(激活完成后开始处理),TSA的处理浓度均为10nmol/L,总的作用时间均为15h,对照组未添加TSA。结果显示,不同的处理阶段对卵裂率、16-细胞期胚胎率及桑椹胚率影响不明显(P>0.05)；在囊胚率方面,培养期处理组囊胚率达到9.7%,显著高于其它各组(9.7% vs.0.0% P<0.05)。说明TSA在培养期处理牛孤雄胚具有较好的效果。2.5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用培养液中添加浓度为0(对照)、0.1、1和10nmol/L的5-aza-dc,在重构胚激活后培养孤雄胚24h,比较5-aza-dc浓度对孤雄胚体外发育的影响。不同浓度(0.1、1、10nmol/L)的处理组间在卵裂率、16-细胞期胚胎率、桑椹胚率及囊胚率方面差异不显著(P>0.05),但均高于对照组；1 nmol/L处理组胚胎卵裂率显著高于对照组(78.8%vs.60.7% P<0.05),且囊胚率达到7.6%,高于其它各组,表明1nmol/L的5-aza-dc是最佳的处理浓度。用含5-aza-dc 1 nmol/L的培养液在重构胚激活后培养孤雄胚0、15、24和48h,比较5-aza-dc作用时间对孤雄胚体外发育的影响。结果发现,培养24h的胚胎卵裂率、桑椹胚率和囊胚率均显著高于对照组(P<0.05),但与其它处理组(15h和48h)间差异不显著(P>0.05)；在囊胚率方面24h处理组显著高于对照组与15h处理组(P<0.05)。3.TSA对组蛋白乙酰化水平及表观修饰相关基因表达的影响利用组蛋白H3抗体检测组蛋白乙酰化水平,设计四个组,两个对照组(孤雄组与孤雌组)与两个TSA处理组(5nmol/L,20nmol/L),处理时间为胚胎培养期作用15 h,检测体外培养2-5d的胚胎。结果发现,不同浓度(Onmol/L,5nmol/L,20nmol/L)的TSA处理对组蛋白H3的乙酰化水平影响不明显,但均低于同一时期的孤雌胚胎的乙酰化水平；同一处理组(0nmol/L或5nmol/L或20nmol/L)不同发育阶段的胚胎,组蛋白H3的乙酰化水平存在差异,表明孤雄胚的乙酰化水平低于孤雌胚,且随着胚胎发育的进行组蛋白的乙酰化水平逐渐增强。牛孤雄重构胚激活后,用含0、5和20 nmol/L TSA的培养液培养15h,提取胚胎RNA,应用荧光定量PCR方法检测组蛋白去乙酰化酶基因(HDAC1, HDAC2)、乙酰基转移酶基因HAT1与DNA甲基转移酶基因(DNMT3a, DNMT3b, DNMT1)的表达量,发现用TSA处理后,上述所有去乙酰化酶基因和DNA甲基转移酶基因的表达量均下降,且抑制作用随TSA浓度的增加而增强(P<0.05)。基因HAT1在TSA处理后的表达量也低于对照组(P<0.05)。结果表明,TSA能够抑制牛孤雄胚组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基转移酶基因的表达,但并不能促进HAT1基因的表达。