论文部分内容阅读
卵泡刺激素(FSH)在上皮性卵巢癌的形成中具有重要作用。但是,FSH在卵巢癌发生和发展中的分子机制仍不清楚。OCT4(Octamer-binding transcription factor 4)在人类恶性肿瘤的发生和发展中扮演重要角色。我们之前的研究发现OCT4在卵巢癌组织表达与肿瘤分级相关,并且发现OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌的凋亡抑制。然而,OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌转移和侵袭中的作用尚不清楚。因此,在目前的研究中,我们想确定OCT4是否参与FSH诱导的上皮性卵巢癌的转移和侵袭。我们研究发现FSH能够诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化和侵袭。我们还发现FSH能够以剂量依赖和时间依赖的方式上调OCT4蛋白和m RNA的水平。除此之外,FSH刺激上调FSH受体(FSHR)的表达,敲除FSHR表达阻断了FSH诱导的OCT4表达的增加。预先使用MAPK/ERK信号通路阻断剂U0126处理卵巢癌细胞,抑制了FSH诱导的OCT4和Snail表达的上调。我们进一步研究发现使用si RNA干扰敲除OCT4表达阻断了FSH诱导的上皮性卵巢癌细胞中Snail和N-cadherin表达的上调,E-cadherin的下调和细胞形态学的改变。而且,我们还发现OCT4介导FSH诱导的卵巢癌迁移和侵袭能力的增加。总之,我们的研究表明OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌的迁移和侵袭中具有重要作用,OCT4有可能成为上皮性卵巢癌的一个治疗靶点。第一部分FSH诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化和侵袭目的:FSH刺激上皮性卵巢癌细胞株后,观察其形态学变化和侵袭能力改变,并检测上皮间质转化相关标志分子表达的变化。方法:应用不同浓度(0,5,25,50,100m IU/ml)的卵泡刺激素处理上皮性卵巢细胞株Hey和Ho8910,通过Western blotting技术检测上皮间质转化相关标志分子表达的情况。使用不同浓度(0和50m IU/ml)的卵泡刺激素处理上皮性卵巢细胞株Hey和Ho8910,观察两种细胞株FSH刺激后细胞形态学的变化,通过Transwell侵袭实验检测FSH刺激前后细胞侵袭能力的变化。结果:(1)随着FSH浓度的不断增加,上皮细胞标志蛋白E-cadhenrin表达逐渐下调,间质细胞标志蛋白N-cadherin表达逐渐上调,在FSH浓度为50m IU/ml时,下调E-cadherin和上调N-cadherin作用最为显著。从分子表达水平说明FSH能够诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化。(2)使用50m IU/ml浓度的FSH处理两种细胞,可以明显观察到两种细胞从紧凑的椭圆形变成稀疏的长梭形转变。从形态学上说明FSH能够诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化。(3)使用50m IU/ml浓度的FSH处理两种细胞,通过Transwell侵袭实验结果表明FSH可以诱导上皮性卵巢癌侵袭。从功能学方面说明FSH能够诱导上皮性卵巢癌发生上皮间质转化。结论:FSH具有诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化和促进其侵袭的作用。第二部分FSH通过作用于FSHR上调OCT4的表达目的:研究卵泡刺激素(FSH)对OCT4表达的调控作用。方法:使用不同浓度的(0,5,25,50,100m IU/ml)的卵泡刺激素刺激上皮性卵巢癌细胞株Hey和Ho8910,使用Western blotting检测FSHR和OCT4的蛋白的表达情况,RT-q PCR检测FSHR在m RNA表达情况。使用50m IU/ml的FSH分别刺激两种细胞株不同时间(0,0.5,1,3,6,12,24h),同样使用Western blotting检测OCT4的蛋白的表达情况。使用FSHR的si RNA沉默FSHR的表达,应用Western blotting和RT-q PCR检测FSHR和OCT4表达的变化情况。结果:(1)在一定浓度和时间范围内,FSH能显著上调上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910中OCT4的蛋白表达,而且以剂量依赖和时间依赖的方式,在FSH浓度为50m IU/ml作用最明显。(2)在一定浓度范围内,FSH能显著上调上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910中FSHR的m RNA和蛋白表达,而且以剂量依赖的方式,在FSH浓度为50m IU/ml作用最明显。(3)干扰FSHR表达后,阻断了FSH上调OCT4表达的作用。结论:在一定浓度和时间范围内,FSH能够显著上调OCT4的蛋白表达水平。在一定浓度范围内,FSH能够上调FSHR的m RNA和蛋白表达水平,而且FSH通过作用于FSHR上调OCT4的表达。第三部分ERK1/2信号通路参与FSH诱导的OCT4和Snail的表达目的:探索FSH上调OCT4和Snail表达的信号通路。方法:上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910各分为五组,分别为Con,FSH,FSH+LY294002(PI3K/AKT信号通路阻断剂),FSH+U0126(ERK1/2信号通路阻断剂)和FSH+NAC(ROS信号通路阻断剂)。使用Western blotting和RT-q PCR检测OCT4和Snail的表达。结果:(1)使用ERK1/2阻断剂U0126阻断了FSH诱导的OCT4表达的上调,PI3K/AKT信号通路阻断剂和ROS信号通路阻断剂未对FSH诱导的OCT4表达产生影响。(2)使用ERK1/2阻断剂U0126阻断了FSH诱导的Snail表达的上调,PI3K/AKT信号通路阻断剂和ROS信号通路阻断剂未对FSH诱导的Snail表达产生影响。结论:FSH通过ERK1/2信号通路上调OCT4和Snail的表达。第四部分OCT4是FSH诱导的上皮间质转化所必需的目的:明确OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌上皮间质转化中的作用。方法:上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910各分为四组,分别为Con+si-Con,FSH+si-Con,Con+si-OCT4和FSH+si-OCT4。以RNA干扰技术敲除两种细胞中OCT4的表达,同时使用FSH刺激并设立对照。用倒置显微镜观察干扰OCT4后,FSH刺激两种细胞后细胞形态学的变化。使用Western blotting和RT-q PCR检测干扰OCT4后对FSH诱导的上皮间质转化相关指标Snail、E-cadherin和N-cadherin表达水平的影响。结果:(1)干扰OCT4的表达后,FSH对上调Hey和Ho8910细胞中Snail蛋白表达水平明显受到抑制。(2)干扰OCT4的表达后,FSH对Hey和Ho8910细胞中下调E-cadherin和上调N-cadherin的作用被阻断。(3)从形态学上,干扰OCT4的表达后,FSH诱导的上细胞向间质细胞的转化作用被阻断。结论:OCT4是FSH诱导的上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化所必需的。第五部分OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌转移目的:探讨OCT4在FSH诱导的上皮性卵巢癌转移中的作用。方法:上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910各分为四组,分别为Con+si-Con、FSH+si-Con、Con+si-OCT4和FSH+si-OCT4。以RNA干扰技术敲除OCT4在两种细胞中表达,同时使用FSH刺激并设立对照。使用划痕实验和Transwell侵袭实验检测干扰OCT4后,FSH对两种细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:(1)划痕实验结果表明:干扰OCT4表达以后,FSH诱导的上皮性卵巢癌Hey和Ho8910细胞迁移能力增加受到明显抑制,差异具有统计学意义。(2)Transwell侵袭实验结果表明:干扰OCT4表达以后,FSH诱导的上皮性卵巢癌Hey和Ho8910细胞侵袭作用被抑制。结论:在上皮性卵巢癌细胞Hey和Ho8910,OCT4介导FSH诱导的上皮性卵巢癌细胞迁移和侵袭。