论文部分内容阅读
本研究通过定点突变技术,对A/Quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)毒株NS1蛋白114、124、202、212位进行氨基酸置换,并构建出未置换NS1蛋白重组表达质粒p CAGGS-NS1、位点置换重组表达质粒p CAGGS-NS1/P114S、p CAGGS-NS1/M124V、p CAGGS-NS1/T202A、p CAGGS-NS1/S212P。应用反向遗传技术拯救出野生型未置换病毒Re G1-NS1、位点置换病毒Re G1-NS1/P114S、Re G1-NS1/M124V、Re G1-NS1/T202A、Re G1-NS1/S212P。双荧光素酶试验结果显示,与poly(I:C)组相比,NS1蛋白未置换、NS1蛋白P114S、M124V、S212P置换后,对NF-κB、IRF-3、IFN-β启动子的转录活性均有抑制作用,而NS1蛋白T202A置换后对NF-κB、IRF-3、IFN-β启动子的转录活性无显著抑制。与NS1蛋白未置换组相比,NS1蛋白S212P置换后对NF-κB、IRF-3、IFN-β启动子转录活性的抑制作用最为显著,而NS1蛋白T202A置换后对NF-κB、IRF-3、IFN-β启动子转录活性的抑制作用下降。各拯救病毒感染9h后,A549细胞中IFN-β及ISGs的荧光定量结果显示,与Re G1相比,Re G1-NS1/P114S、Re G1-NS1/M124V、Re G1-NS1/S212P感染A549细胞后,能进一步抑制IFN-β及ISGs m RNA的转录。其中以Re G1-NS1/S212P对IFN-β及ISGs m RNA转录的抑制作用最为显著。而与Re G1相比,Re G1-NS1/T202A感染A549细胞后,对IFN-β及ISGs m RNA的转录无显著抑制作用。拯救病毒攻毒后第3天和第7天,鸡肺组织中I型干扰素通路分子及IFs的荧光定量结果显示,与Re G1相比,Re G1-NS1/P114S、Re G1-NS1/M124V、Re G1-NS1/S212P感染后,能进一步抑制I型干扰素通路分子及IFs m RNA的转录,使拯救病毒能更好地在体内增殖与复制。其中以Re G1-NS1/S212P对I型干扰素通路分子及IFs m RNA转录的抑制程度最为显著。而与Re G1相比,Re G1-NS1/T202A攻毒后,对I型干扰素通路分子及IFs m RNA的转录无显著抑制作用。以上实验结果在蛋白及病毒水平上显示,与未置换NS1蛋白相比,NS1蛋白P114S、M124V、S212P置换后可进一步抑制I型干扰素IFN-α/β等炎性因子及ISGs m RNA的转录,拮抗先天性免疫应答及炎症反应。而NS1蛋白T202A置换后对机体先天性免疫应答及炎症反应无进一步抑制作用。