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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性微需氧菌,呈螺旋杆状[1,2]。H.pylori在全世界范围内感染率超过50%,在亚洲、非洲及南美洲等世界欠发达地区H.pylori感染率更高[3]。感染后可以长期定植于人类胃粘膜,是引起胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关的淋巴样组织淋巴瘤和胃腺癌的重要病原体[4-7]。1994年,H.pylori被世界卫生组织列为I类致癌因子,这也是目前为止唯一被列为I类致癌因子的病原细菌。H.pylori与胃十二指肠疾病关系密切,其细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated gene A,Cag A)是H.pylori最重要的毒力因子之一[8]。H.pylori定植于胃上皮表面,通过特有的IV型分泌系统(type IV secretion system,TFSS)将Cag A蛋白注入宿主细胞,从而干扰宿主细胞功能,产生毒性作用[9]。本实验利用经过人工优化和人源化后的cag A不同亚型基因,构建成cag A六种不同亚型真核表达载体,分别转染胃上皮细胞AGS后,观察与分析比较了H.pylori Cag A EPIYA多态性对胃上皮细胞形态及IL-8表达的影响。与此同时,我们收集了河北地区131例H.pylori感染阳性的胃病患者标本,检测了感染H.pylori的Cag A EPIYA基序亚型,分析了其对胃病患者发生胃病种类及程度的影响。本实验分为如下三部分:一、cagA各亚型基因的优化、人工合成及其真核表达载体的构建通过NCBI Blast H.pylori cag A序列,共选取6条代表cag A各亚型基因的序列,分别为cag A 98-10、cag A Ca52、cag A NCTC11637、cag A F75、cag A PNGhigh85和cag A Shi470。上述基因利用密码子偏爱性、基因GC含量、二核苷酸序列等分析后,优化合成了4条全新的NCTC11637、F75、PNGhigh85和Shi470 cag AHS基因C端序列(cag A 98-10HS基因和cag A Ca52HS基因本实验室之前保存)。采用重组克隆试剂盒方法,将pcDNA3.1、cagA 98-10 N端分别与cagA NCTC11637HS、cag A SHI470HS、cag A PNGhigh85HS和cag A F75HS C端连接,构建了真核表达载体pc DNA3.1-cag A NCTC11637HS,pc DNA3.1-cag A F75HS,pc DNA3.1-cag A PNGhigh85HS和pc DNA3.1-cag A Shi470HS,加上实验室原先构建的pc DNA3.1-cag A 98-10HS和pc DNA3.1-cag A Ca52HS,共获得cag A六种不同亚型的真核表达载体。二、不同亚型Cag A对AGS细胞形态及IL-8表达的影响对AGS细胞进行复苏、培养及传代,采用Western Blotting鉴定各型cagAHS真核表达载体瞬时转染入AGS后Cag A蛋白的表达。GAPDH为内参蛋白,空载体pc DNA3.1转染细胞为阴性对照,表明各型Cag A在AGS细胞内均成功表达,其在转染效率上的差异不具有统计学意义。各型cag AHS表达质粒瞬时转染AGS后于48h内观察细胞形态变化及IL-8表达,设空载体pc DNA3.1为阴性对照。转染后每隔6h进行细胞形态观察,于24h、36h对形成“蜂鸟状”细胞的数量进行统计分析,结果表明,各亚型Cag A均能引起发生“蜂鸟状”改变的细胞数量增加。较空载体对照,转染后24h和36h,Cag A六种亚型皆有非常显著差异(P<0.001),Cag A ABCCC与其余五种Cag A亚型有非常显著差异(P<0.001),Cag A ABDD与Cag A ABC和Cag A J-Western有非常显著差异(P<0.001);24h时,Cag A ABDD与Cag A Amerindian有非常显著差异(P<0.001);36h时,Cag A ABD分别与Cag A ABC和Cag A J-Western有非常显著差异(P<0.01)。同时于转染后12h、36h对细胞分泌的IL-8进行检测,统计分析表明,转染后12h,较空载体对照,Cag A ABDD存在非常显著差异(P<0.01);转染后36h,较空载体对照,Cag A ABD和Cag A J-Western存在非常显著差异(P<0.01),Cag A ABDD和Cag A ABCCC存在非常显著差异(P<0.001);Cag A Amerindian与Cag A ABD和Cag A J-Western分别存在非常显著差异(P<0.01),与Cag A ABDD和Cag A ABCCC分别存在非常显著差异(P<0.001);Cag A ABDD和Cag A ABCCC分别与Cag A ABD、Cag A ABC和Cag A J-Western存在非常显著差异(P<0.001)。三、CagA EPIYA多态性与胃病的关系研究在中国,H.pylori感染及胃癌的发生均比较高,但有关H.pylori细胞毒素相关蛋白Cag A与胃病种类及程度的关系研究鲜有报道,而Cag A EPIYA基序与胃病及胃癌的关系研究的报道更少。本研究初步探究了H.pylori Cag A(+)EPIYA基序种类与胃病严重程度的关系。本研究从临床共收集到131例H.pylori感染阳性的胃病患者标本,其中经胃镜观察和病理诊断有37例属于慢性胃炎,42例胃溃疡,35例十二指肠溃疡及17例胃腺癌。经PCR扩增鉴定Cag A阳性117例,占总数89.3%。Cag A阳性中,有92例含有东亚型EPIYA-D基序,占78.6%,其中大多数为Cag A ABD(64.1%);有19例含有EPIYA-C基序,占总数的16.2%。Cag A ABD型在胃腺癌与非胃癌病例中分布具有统计学意义(P<0.001),胃腺癌患者感染的幽门螺杆菌全部为Cag A ABD亚型,预测感染H.pylori为Cag A ABD亚型时患者患胃腺癌的风险性高。