在众多的药物成分中,除了具有共轭生色团结构的成分外,还有许多成分无生色团,其在紫外-可见光区无吸收,通常称之为“非紫外活性成分”,如双膦酸盐(该类药物中大部分无紫外吸收基团)、多元醇、生物碱等,这些物质一般都具有很强的生理活性,一直是人们研究的热点。但是由于这些成分无紫外吸收,采用常规的分析方法困难,特别是某些不但无紫外吸收而且极性大、不易挥发的成分,在非极性色谱柱上难保留,同时很难采用气相色谱法进行分析测定。目前,文献对该类成分的分析多采用离子交换色谱配以示差折光检测器或质谱检测器。本课题采用现代的分析手段如蒸发光检测器(ELSD)、流动注射-化学发光、毛细管电泳等,建立了双膦酸盐、多元醇、生物碱的新的检测方法,如下所示的这些方法可为含有此类成分的药物的质量控制提供有效可靠的分析手段。(1)本课题采用挥发性的正戊胺作为流动相添加剂,结合蒸发光检测器建立了双膦酸盐的反相液相色谱分析方法;(2)对于具有末端紫外吸收的双膦酸盐,建立了毛细管电泳-紫外检测的分析方法。(3)对于氨基双膦酸盐建立了以AQC为柱前衍生试剂的新的、特异的反相液相色谱-间接紫外检测的方法,该衍生反应步骤简便,衍生产物稳定,过量的衍生试剂不需要经过特殊处理,其可在2分钟内水解成AMQ,且水解产物不干扰测定。(4)此外,试验发现双膦酸盐对鲁米诺-H2O2-Cu(Ⅱ)化学发光体系有增敏作用,据此建立了高效、特异的流动注射-化学发法测定双膦酸盐,试验结果表明药物中的辅料及其有关物质(磷酸盐和亚磷酸)均不干扰测定,其检测灵敏度可达蒸发光检测的100倍,灵敏度与传统的钼蓝法相当。(5)多元醇类成分常规的分析方法为示差折光检测法,但其灵敏度低,本课题采用蒸发光检测器建立了肌醇的分析方法。(6)生物碱类无紫外吸收,文献多采用其末端紫外吸收进行检测,但方法的灵敏度低、干扰多,本课题同样采用蒸发光检测器建立了一种简便、快速、特异性好的HPLC- ELSD法分析测定氧化苦参碱。一、双膦酸类药物的分析与测定(一)英卡膦酸二钠及有关物质的HPLC-ELSD法测定目的:建立简便、特异的HPLC-ELSD法测定英卡膦酸二钠及其有关物质。方法:采用Inertsil C8色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为添加了0.0175 mol·L-1正戊胺的水溶液(乙酸调节pH至7.3)-乙腈(90:10);流速1.0 mL·min-1;柱温30℃。结果:英卡膦酸二钠在31.5~1.01×103μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好(r=0.999 7),英卡膦酸二钠及其有关物质(磷酸盐和亚磷酸)的最低检测限分别为15.8、3.13、3.17μg·mL-1。注射用英卡膦酸二钠的平均回收率为100%,RSD为0.9%。结论:本文采用可挥发性的正戊胺作为流动相添加剂,建立了同时分析英卡膦酸二钠及其有关物质(磷酸盐和亚磷酸)的特异的HPLC-ELSD法,即解决了它们的保留与检测问题,又同时满足了ELSD的使用要求。所建立的反相液相色谱法为英卡膦酸二钠原料药及其制剂的常规分析及质量控制提供了有效可靠的手段。(二)毛细管区带电泳测定唑来膦酸及其制剂的含量目的:建立简便、快速分析唑来膦酸及与其有关物质的毛细管区带电泳方法。方法:采用非涂渍石英毛细管(50 cm×50μm)为分离通道,3 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.9)为运行缓冲体系;工作电压25 kV;进样电压2 kV,进样时间5 s;紫外检测波长为210 nm。结果:唑来膦酸在31.2~998μg·mL-1的范围内线性关系良好(r=0.999 7);注射用唑来膦酸和唑来膦酸注射剂的平均回收率分别为99.6%、100%,RSD分别为1.1%、1.0%;最低检测限为15.6μg·mL-1,该条件下唑来膦酸与其有关物质分离良好。结论:本文建立了一种简单、快速且可以同时分析唑来膦酸及其有关物质咪唑乙酸的毛细管区带电泳法,该法较文献报道的离子对色谱法、离子交换色谱法操作过程简便,分析速度快(唑来膦酸与咪唑乙酸的迁移时间分别为4.2 min、2.4 min),结果准确可靠,为唑来膦酸生产及制剂过程中的质量控制提供了一种新的可靠的分析手段。(三)以AQC为衍生试剂的高效液相色谱法同时分析阿仑膦酸钠及其有关物质(γ-氨基丁酸)目的:建立一种新的衍生方法同时测定阿仑膦酸钠及其有关物质(γ-氨基丁酸)。方法:采用Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5μm),以乙腈-35 mmol·L-1乙酸钠缓冲液(内含1%三乙胺,乙酸调pH6.8)(13.5:86.5)为流动相进行等度洗脱。柱温35℃;紫外检测波长254 nm;流速0.7 mL·min-1.。结果:阿仑膦酸钠及γ-氨基丁酸在15.5~990μg·mL-1、0.307~960μg·mL-1的范围内线性关系良好(相关系数均不低于0.999 5)。二者的最低检测限分别为7.75、0.154μg·mL-1。在该条件下,阿仑膦酸钠、γ-氨基丁酸以及衍生副产物AMQ之间分离良好。结论:本文建立了一种以AQC为衍生试剂的反相液相色谱-紫外检测法同时分析阿仑膦酸钠及其有关物质(γ-氨基丁酸),方法特异性好、灵敏度高,有关物质及制剂中的辅料不干扰阿仑膦酸钠的测定。本试验所建立的衍生方法较文献采用的OPA以及FMOC衍生方法优点多:衍生过程简便;衍生产物稳定(至少一周);过量的衍生试剂不需经过特殊处理,2分钟内即可迅速水解,水解产物AMQ不干扰测定。本方法不仅可用于阿仑膦酸钠原料药及其制剂的质量控制,还可用于阿仑膦酸钠片剂的溶出度试验。(四)一种新颖的、快速的流动注射-化学发光法测定伊班膦酸钠目的:通过联用流动注射与化学发光技术,建立一种新颖的、快速、特异的测定伊班膦酸钠的方法。方法:将伊班膦酸钠溶液用1×10-4 mol·L-1的Cu (II)溶液稀释。一个具有两个通路的蠕动泵用来分别传送伊班膦酸钠溶液及1×10-6 mol·L-1的鲁米诺溶液,另一蠕动泵用来输送载液(1% H2O2溶液),泵速分别为1.2、2.9 mL·min-1,溶液经六通阀混合后注入流通池。用同样的程序测定空白信号,并对所建立的方法进行方法学验证。结果:在优化的条件下,发光信号的增加值(ΔI)正比于伊班膦酸钠溶液的浓度。伊班膦酸钠在1.56~99.9μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好,最低检测限为0.53μg·mL-1,RSD 1.8%,平均回收率约为100%。伊班膦酸钠注射剂中的辅料及有关物质(磷酸盐、亚磷酸以及3-甲基戊胺基甲酸)均不干扰测定。结论:本文建立了一种新颖的、快速、特异的流动注射-化学发光法分析伊班膦酸钠。该方法较文献报道的方法分析优点多:仅40 s即为一个分析周期;检测灵敏度可达蒸发光检测的100倍,与传统的钼蓝法相当;其有关物质及制剂中的辅料均不干扰伊班膦酸钠测定。该方法可用于伊班膦酸钠的质量控制,并可实现自动化、用于生产过程中的现场分析。(五)一种快速的流动注射-化学发光法测定阿仑膦酸钠目的:通过联用流动注射与化学发光技术,建立一种快速测定阿仑膦酸钠的方法。方法:将阿仑膦酸钠溶液用1×10-4 mol·L-1的Cu (II)溶液稀释。一个具有两个通路的蠕动泵用来分别传送这一阿仑膦酸钠溶液及4×10-7 mol·L-1的鲁米诺溶液,另一蠕动泵用来输送载液(0.1% H2O2溶液),泵速分别为1.2、2.9 mL·min-1,溶液经六通阀混合后注入流通池。用同样的程序测定空白信号,并对所建立的方法进行方法学验证。结果:在优化的条件下,发光信号的增加值(ΔI)正比于阿仑膦酸钠的浓度。阿仑膦酸钠在1.24~49.6μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好,最低检测限为0.41μg·mL-1,RSD 1.3%,平均回收率为99.8%。阿仑膦酸钠片剂中的辅料及有关物质(磷酸盐、亚磷酸)均不干扰测定。结论:本文所建立的流动注射-化学发光法分析速度快、灵敏度高、特异性好:40 s即为一个分析周期;检测灵敏度可达蒸发光检测的100倍,与传统的钼蓝法相当;其有关物质及制剂中的辅料均不干扰测定。该方法可为阿仑膦酸钠的质量控制提供新的分析手段同时可用于阿仑膦酸钠片剂的溶出度试验,并可实现自动化,用于生产过程中的现场分析。第二部分其他极性非紫外活性成分的分析、测定及其在药物分析中的应用(一)高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定赖氨肌醇维B12口服液中肌醇含量目的:建立简便、快速的HPLC-ELSD法测定复方制剂中肌醇含量。方法:采用Kromasil NH2色谱柱,流动相为甲醇-水(60:40),流速0.8 mL·min-1,柱温室温。结果:肌醇在157~2.51×103μg·mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.999 6),最低检测限为39.3μg·mL-1,平均回收率99.6%,RSD为0.8%。在该条件下,样品中辅料及其他成分不干扰肌醇测定。结论:本文建立了一种新的、简便、快速的HPLC-ELSD法测定复方制剂中的肌醇含量,样品不需预处理,避免了衍生等步骤给分析带来的不便,较通常采用的折光检测法灵敏度高,该方法的建立为食品、药品中该成分的测定提供了一种新的可靠的分析手段。(二)苦参素胶囊中氧化苦参碱的HPLC-ELSD测定目的:建立HPLC-ELSD法测定苦参素胶囊中的氧化苦参碱。方法:采用Diamonsil C18色谱柱,以乙腈-水(含0.5%三乙胺,醋酸调pH 5.5)(10:90)为流动相,流速1.0 mL·min-1,柱温室温。结果:氧化苦参碱在16.0~513μg·mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.999 9),最低检测限为4.00μg·mL-1,平均回收率为100%,RSD为0.8%。结论:本文采用普通的C18色谱柱,在优化的色谱体系下即可使氧化苦参碱得到很好的保留且峰形好,并可与其在纯化制备过程中最有可能混入的其他生物碱(氧化槐果碱)达到基线分离。本文所建立的HPLC-ELSD法较文献采用的离子抑制色谱、离子对色谱、氨基柱-RP-HPLC法简便、快速,为含有该成分药物的测定提供了一种新的分析手段。