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第一部分 MSC的体外培养和绿色荧光蛋白基因的转入 材料和方法 纯系雄性Wistar大鼠（130～150g） 1、MSC的分离、培养 以Wistar大鼠为供体,胫骨离断,自骨髓腔内获取的骨髓标本,采用Percoll密度梯度离心法分离取得单个核细胞层,或者直接采用贴壁法,加入L-DMEM培养液,培养传代。 2、表面标志物的检测 取第3代的贴壁细胞悬液,加入荧光标记小鼠抗大鼠单抗CD34-FITC,CD45-PE,CD44-FITC,CD29-PE和同型阴性对照小鼠抗小鼠IgG1-FITC和IgG2a,流式细胞仪检测分析。 3、定向诱导MSC向脂肪细胞分化 取第3代的贴壁细胞制成单细胞悬液,加入脂肪细胞诱导液,14d后用油红O染色,光镜观察。 4、pEGFP-C2载体的扩增与鉴定 通过大肠杆菌DH5α,将pEGFP-C2质粒进行扩增,再经SDS碱裂解法抽提,NheⅠ和AseⅠ双酶切鉴定。钱浩然浙江大学博士学位论文（专业学位）5、pEGFp一C:转染MSC 通过Tfx一50和FuGene6试剂分别将pEGFP转染MSC,比较转染效率。经过G418筛选,得到阳性克隆,激光共聚焦扫描显微镜检测。6、MTT法测定细胞增殖 用MTT法检测不同方法转染48h后的细胞活力,判断何种方法对于细胞增殖更为有利。结果:1、利用密度梯度离心法和贴壁法均可以成功在体外分离、培养MSC。密度梯度 离心法细胞生长较贴壁法缓慢,但杂质细胞较少。在传到第3代时两种方法 细胞纯度类似,均可以到达93%。2、培养至第3代的MSC膜表面CD34阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD29阳 ,胜。3、从诱导分化的第4一sd起,光镜下观察可见淡黄色的脂滴沉着的细胞,形状 变为圆形或椭圆形,细胞核可被脂滴挤偏于一侧。油红O染色见脂滴呈红染, 胞核呈蓝染。对照组的细胞形态未见变化。4、和Tfx一50相比,采用FuGENE6转染MSC显示出更高的转染效率和细胞活 力。5、在FuGENE6:DNA二6:1的优化条件下,MSC能在体外长期稳定的表达绿 色荧光蛋白,未转染上的细胞在G418的筛选下逐渐死亡。6、转染后24小时,激光共聚焦扫描显微镜下可以观察到明亮的绿色荧光。通过 荧光强度,可以看出筛选一个月后转染效率达到70%。7、体外培养一个月期间,这些细胞能够持续稳定表达荧光（6代）,6代以后荧 光强度减弱。结论:1、密度梯度离心法和贴壁法均可以成功分离培养MSC,两者各有优缺点。2、MSC的鉴定可通过细胞形态,膜表面标志物的共性和分化能力来实现。3、运用FuGENE6可以安全有效的转染MSC,转染后的细胞能在体外长期稳定 的表达绿色荧光蛋白。钱浩然浙江大学博士学位论文（专业学位）第二部分MSC体外抑制同种异体T淋巴细胞的实验研究材料和方法:1、T淋巴细胞的制备 无菌条件下取大鼠脾脏,研磨成细胞匀浆。用红细胞裂解液破坏其中的红细胞,用玻璃器乳附法去除其中的单核细胞,用尼龙棉吸附法纯化T淋巴细胞得到标本。2、流式细胞术检测T淋巴细胞的膜表面分子CD25和CD69 标本细胞收集后用PBS冲洗,调整细胞密度,加入荧光标记单抗,避光孵育20 min然后上机检测。3、具体的试验分组 按MSC多少分为四组:100个,10000个,100000个和空白对照;按共培养时间长短分为五组:共培养24h,48h,72h,96h和空白对照;按不同免疫抑制剂分为四组:共培养组,MSC上清液作用组,CsA作用组和空白对照组。结果:l、CD3+的T淋巴细胞达到了75%士8%,台盘兰拒染率达到了95%士2%。2、就CD25的表达而言,100个MSC时为65%士20%,10000个MSC时为 30%士16%,100000个MSC时为20%王7%,对照组为62%士19%。3、就CD25的表达而言,共培养24h时为220/ot18%,共培养48h时为23%士14%, 共培养72h时为20%士7%,共培养96h时为28%士18%。4、就CD25的表达而言,共培养时为20%士7%,上清液处理组为28%士17%,CsA 处理组为35%士26%,对照组为62%士19%。5、实验中CD69的表达未发现组间的差异。结论:1、100个MSC不引起T淋巴细胞增殖的抑制,10000个以上MSC引起T淋巴 细胞增殖的抑制并且有数量依赖性,表现为CD25表达率下降,CD69没有变 化;2、MSC对于T淋巴细胞增殖的抑制作用可以持续%h,然后开始下降。3、MSC对于T淋巴细胞增殖的抑制作用源于一种可溶性蛋白质,细胞与细胞接