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青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科艾属一年生草本植物。青蒿素是从青蒿地上部分分离的一种倍半萜内酯化合物,是目前世界上公认的治疗疟疾最有效的药物。青蒿的青蒿素含量通常比较低,而通过人工合成青蒿素的成本很高,价格昂贵,所以利用现代生物技术提高青蒿素的产量一直是国内外相关领域的研究热点。上海交通大学唐克轩课题组分别克隆了青蒿素合成途径的5个关键酶基因,构建了4种提高青蒿素含量的转基因青蒿品系ANF176、SQS159、GFH13、CYP32,并已经完成了中间试验,获得了我国农业部颁发的环境释放试验审批证书,是国际第一例国家批准进行环境安全评价的转基因药用植物,其环境安全评价对我国转基因生物安全研究领域具有重要意义。
本文通过对转基因青蒿和其受体材料的形态学差异性、生存竞争能力、外源基因表达稳定性的比较,以及基因漂移等几个方面进行评价研究,为我国转基因药用植物的环境安全评价平台的建立提供了参考。另外本研究为建立转基因青蒿PCR技术检测方法,对青蒿物种进行分析研究后,确定了Gel4基因作为青蒿的内标准基因,为以后转基因青蒿的检测奠定了基础。本研究取得以下创新性成果:
1.在环境释放条件下,研究了三种转基因青蒿品种(ANF176、SQS159、GFH13)和其受体材料(FSN-2005)的种子发芽率、叶片形态特征、株高、茎粗、冠幅和千粒重等农艺性状的形态学差异,分析了各个农艺性状指标之间的相关性,研究表明:在田间栽培条件下,转基因青蒿植物个体发育正常,转基因青蒿在株高,冠幅,茎粗,叶间距,叶形,叶片宽度方面与其亲本材料没有显著差异,转基因青蒿和其受体材料的生长趋势大致相似。
2.本研究从耐盐性、耐旱性、耐除草剂以及越冬性几个方面比较了转基因青蒿(ANF176、SQS159、GFH13)和其受体材料(FSN-2005)的生存竞争能力。研究表明:在旱、盐胁迫下,通过测定三种转基因品系和其野生型受体的叶片相对含水量、过氧化物酶、脯氨酸等生理指标。结果显示,转基因青蒿品系ANF176、GFH13的株高、茎粗显著低于其野生型受体,转基因青蒿品系SQS159的冠幅和千粒重显著高于其野生型受体。其他指标的比较试验研究显示转基因青蒿品系与其野生型受体没有显著差异性。在本次试验条件下,这三种转基因青蒿品系具有与野生型类似的抗逆能力(耐盐性、耐旱性),转基因青蒿与野生型对两种除草剂克无踪和金都尔不具有耐受性。
3.在环境释放条件下,利用实时荧光定量逆转录PCR(Real-timeRT-PCR)技术检测三种转基因青蒿(ANF176、SQS159、GFH13)外源基因表达稳定性情况,结果显示,转入基因表达变化显著,最高达到9.65倍;利用(HPLC-ELSD)技术测定青蒿材料中的青蒿素含量,ANF176和SQS159的青蒿素含量分别达到13.82mg/g和14.45mg/g,GFH13的青蒿素含量也在12mg/g以上,显著高于其受体材料FSN-2005的青蒿素含量(9.88mg/g)。并且均在开花前期达到最高值,与预期结果一致。
4.在环境释放条件下,对转基因青蒿CYP32品系进行了基因漂移实验,根据当季环境情况得到最大基因漂移频率2.5%,最大漂移距离为24.4m,在29.2m处则不能检测到漂移。
5.本文建立了转基因青蒿的PCR技术检测方法。选取16种具有不同遗传背景的青蒿栽培品种,对Gel4基因进行验证,得到了相同的扩增产物,说明具有种内非特异性;对16中不同植物进行扩增均无扩增产物,说明具有种间特异性;利用southernblot分析得到具有3个拷贝,符合低拷贝数的特点;进行灵敏度验证得到定性PCR的检出限为0.05ng;对10个青蒿品种进行Gel4基因的克隆测序后,进行序列比对后发现引物具有高度保守性。因此,Gel4基因可以作为青蒿的内标准基因。