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CRISPIR/CAS9系统是重要的基因编辑技术。研究证实，Rosa26基因编码一种非必需的RNA，可作为外源基因插入位点。为使成肌细胞特异性表达Cas9蛋白的序列插入到C2C12细胞中，本研究利用CRISPIR/Cas9系统在小鼠Rosa26位点将连有MCK启动子的Cas9蛋白与荧光报告基因通过同源重组的方法定点插入，并通过嘌呤霉素筛选获取阳性细胞。通过本研究获得以下结果。 1.Rosa26-sgRNA载体的构建 根据小鼠Rosa26一段含有XbaⅠ的序列设计Oligo引物（gRNA），经退火后获得的双链DNA序列与经BbsⅠ单酶切过的PX459载体进行连接，获得载体Rosa26-PX459;利用Lipo2000将Rosa26-PX459载体转染小鼠成纤维细胞后第48h，提取基因组DNA;Rosa26位点上下设计引物并进行PCR。经XbaⅠ酶切鉴定结果，与野生型出现2个条带相比，转染Rosa26-PX459载体的PCR产物出现3个条带（未完全切开）。上述结果表明gRNA可以引导Cas9蛋白对Rosa26位点实现基因编辑。 2.MCK-Cas9载体的构建 采用PCR法扩增获得含有SP1和RBS等调控原件的小鼠肌肉型肌酸激酶(MCK)启动子1358bp片段;将其与切除CMV启动子的Rosa26-PX459连接，成功构建小鼠肌肉特异性CRISPR/Cas9载体Rosa26-PX459-MCK。将该重组质粒使用Lipo2000转染C2C12细胞后第48h提取DNA与RNA。使用XbaⅠ酶切PCR产物出现3个条带（未能完全切开）。再使用T7E1酶切验证，结果PCR产物可以被切割成2条小片段，对琼脂糖凝胶电泳结果进行灰度分析，发现突变率为15％，低于CMV启动子的24％。qPCR结果表明转染Rosa26-PX459-MCK载体的C2C12细胞的Cas9表达量是转染Rosa26-PX459载体的C2C12细胞的20％。 3.小鼠Rosa26位点同源臂打靶载体的构建 为了便于后续实验的观察与检测，在DsRed序列前加上T2A序列，将其连接到Rosa26-PX459-MCK载体Cas9序列下游。从重组质粒上PCR扩增MCK-Cas9-T2A-DsRed序列，将其连接到连有小鼠Rosa26位点左右同源臂的Donor载体上，获得Donor-MCK-Cas9-T2A-DsRed载体。使用同样的方法将原始CMV启动子的片段CMV-Cas9-T2A-DsRed连接到Donor载体上，获得Donor-CMV-Cas9-T2A-DsRed载体。 4.嘌呤霉素抗性细胞的筛选和基因插入的验证。 将同源打靶载体转染C2C12细胞和293T，结果发现转染Donor-CMV-Cas9-T2A-DsRed载体的293T细胞何和C2C12细胞既能观察到红色荧光也能观察到绿色荧光，表明载体进入细胞中且Cas9也能表达;而转染Donor-MCKCas9-T2A-DsRed载体的293T细胞只能观察到绿色荧光，而C2C12细胞既能观察到红色荧光也能观察到绿色荧光，MCK启动子能在C2C12中启动基因表达而不能在293T细胞中发挥作用，表明MCK启动子有肌肉特异性表达活性。Rosa26-PX459载体分别与同源打靶载体共转染C2C12细胞48h后，都能够观察到绿色荧光与红色荧光。加入1ug/mL的嘌呤霉素筛选7天后提取基因组，在插入位点附近，针对基因组与插入片段分别设计上下游引物，PCR结果表明，两个同源打靶载体均可整合到小鼠基因组的Rosa26位点。 上述结果表明，本研究通过CRISPIR/CAS9系统打靶小鼠Rosa26基因位点，并成功在该位点分别插入MCK-Cas9-T2A-DsRed与CMV-Cas9-T2A-DsRed序列，成功建立小鼠C2C12细胞外源基因敲入方法，为转基因小鼠的制备奠定了基础。