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lncRNA NCK1-AS1是我们前期基于TCGA宫颈癌测序数据筛选到的新的宫颈癌预后标志物之一,其位于3号染色体长臂22区3亚带,根据ENCODE组蛋白修饰数据和ChromHMM染色体状态分割数据分析,发现NCK1-AS1基因在肿瘤中处于活跃转录状态。通过qRT-PCR和RNA原位杂交实验检测发现,NCK1-AS1在宫颈癌组织异常高表达,提示NCK1-AS1能够促进肿瘤的发生发展。目前,lncRNA NCK1-AS1在宫颈癌的生物学功能及分子机制尚未阐明,故我们以宫颈癌为研究模型,重点探索NCK1-AS1宫颈癌细胞增殖、周期、侵袭等生物学功能中的作用,并阐明其发挥功能的分子生物学机制。第一部分NCK1-AS1在宫颈癌中的表达及临床意义分析目的:基于TCGA数据库中宫颈癌测序数据和临床资料,深入挖掘宫颈癌预后相关的lncRNAs。分析NCK1-AS1在宫颈癌组织中表达水平,及其与宫颈癌患者临床病理参数的关系。方法:利用COX回归比例分析模型寻找宫颈癌预后相关的lncRNAs,应用基因表达谱分析、qRT-PCR及RNA原位杂交技术,检测lncRNA NCK1-AS1在宫颈癌组织中的定位及表达水平,统计学分析lncRNA NCK1-AS1与患者的年龄、病理分期、肿瘤大小和淋巴结状态之间的关系。结果:通过单因素COX回归比例分析模型,共得到4个宫颈癌预后显著相关的lncRNAs。qRT-PCR和RISH检测结果显示:NCK1-AS1在31例宫颈癌组织中有24例(77.4%)显著高表达;RNA原位杂交染色,lncRNA NCK1-AS1主要定位于细胞质中;统计学分析结果显示:lncRNA NCK1-AS1在宫颈癌中表达量与组织类型(P<0.05)及淋巴结状态(P<0.001)显著相关。结论:lncRNA NCK1-AS1是我们最新鉴定的宫颈癌预后标志物之一,其在宫颈癌组织中异常高表达,且其表达量与宫颈癌患者的临床特征存在相关性。第二部分NCK1-AS1在宫颈癌细胞中的作用目的:明确NCK1-AS1基因的上游核心启动子区及上游调控机制,检测NCK1-AS1对宫颈癌细胞CaSki、SiHa和HeLa的增殖、周期、克隆形成及侵袭能力的影响;裸鼠体内成瘤实验检测沉默NCK1-AS1后对宫颈癌增殖能力的影响。方法:构建NCK1-AS1启动子区不同长度的荧光素酶报告基因重组质粒,双荧光素酶活性分析NCK1-AS1核心启动子区位置。FISH和qRT-PCR检测NCK1-AS1在宫颈癌细胞CaSki、SiHa和HeLa中表达情况。采用si RNA沉默NCK1-AS1表达后,流式细胞技术、Ed U、CCK-8和transwell分别检测细胞周期,DNA合成(S期)的变化,增殖和侵袭能力,平板克隆实验检测NCK1-AS1对细胞克隆形成能力影响,裸鼠成瘤实验检测NCK1-AS1对细胞体内成瘤能力的影响。结果:FISH和qRT-PCR检测NCK1-AS1在CaSki、Si Ha和HeLa中的表达,发现NCK1-AS1细胞质和细胞核中表达,主要定位在细胞质中表达,且NCK1-AS1在人宫颈癌肠转移CaSki细胞中表达最高。qRT-PCR和ChIP实验证实转录因子SP1结合到NCK1-AS1启动子区,直接调控其表达。我们利用siRAN技术在CaSki和SiHa细胞中沉默NCK1-AS1,CCK8实验实验结果显示,沉默NCK1-AS1后抑制了宫颈癌细胞的增殖能力。流式细胞仪和EdU实验结果显示,siRNA干扰组G1期细胞数量和对照组无明显变化,S期细胞数量比对照组明显减少,G2/M期细胞数较比照组明显增加;沉默NCK1-AS1后抑制了宫颈癌细胞CaSki和SiHa DNA合成,细胞在G1/S或G2/M的转换中受到阻滞,延迟细胞周期的进程。运用稳定低表达NCK1-AS1的CaSki细胞和对照组CaSki细胞皮下注射裸鼠体内,结果显示,NCK1-AS1干扰组(n=3)裸鼠肿瘤的生长体积明显慢于对照组(n=3),肿瘤的重量也显著低于对照组。结论:转录因子SP1结合到NCK1-AS1启动子区并调控其表达。LncRNA NCK1-AS1在宫颈癌中异常高表达并驱动细胞周期和增殖第三部分NCK1-AS1在宫颈癌发生发展中的分子机制研究目的:阐明NCK1-AS1在调控宫颈癌细胞周期和增殖中下游分子机制。方法:运用基因表达谱芯片分析沉默NCK1-AS1后差异表达基因,GO和pathway富集分析差异基因参与的信号通路;生物信息学、qRT-PCR、WB和双荧光素酶报告实验验证NCK1-AS1、miR-6857和CDK1三者间相互作用关系。结果:GeneChip Human Transcriptome Array结果显示:实验组中沉默NCK1-AS1后有493个显著差异的编码蛋白基因,其中165个上调基因和228个下调基因;413个显著差异的非编码蛋白基因,其中301个上调基因和112个下调基因。对493个显著差异的编码蛋白基因进行GO和Pathway的富集分析结果,影响的通路主要集中Focal adhesion、Pathways in cancer、cell cycle、Metabolic pathways以及PI3K-Akt signaling pathway等途径。LV-NCK1-AS1转染后增加了HeLa细胞的侵袭和增殖能力,突变型LV-NCK1-AS1 MT转染后对细胞的侵袭增殖没有明显影响,而转染mi R-6857 mimics后能够消除LV-NCK1-AS1促增殖侵袭的能力,这说明NCK1-AS1是通过调控miR-6857在宫颈癌的中发挥的作用。结论:NCK1-AS1作为“海绵吸附”负向调控miR-6857解除了靶基因CDK1的抑制作用,从而促进了宫颈癌细胞的周期和增殖。