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禽流感（Avian Influenza,AI）由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起,在禽类上表现为呼吸系统疾病到全身败血症等多种病症。其中H3亚型AIV不仅可以感染禽类,对养禽业造成经济损失,同时也具有感染哺乳动物的风险,威胁公共卫生安全。我国华东地区水网交错,交通往来发达,是许多候鸟迁徙的必经之地,同时存在的活禽交易市场模式,导致流感病毒很容易在此演化重组并且传播到家禽和其它候鸟群体中。H3亚型AIV感染家禽后无明显临床症状,当与其它亚型流感病毒同时感染可能发生基因重组产生新的流行株。目前针对我国H3亚型AIV遗传演化、致病性和传播特性的系统性研究相对较少,本研究根据地域、宿主、时间的不同选取2014-2021年7株有代表性的H3亚型AIVs,分析了病毒流行特点,进行了遗传进化分析,测定了分离株生物学特性和受体结合特性,开展了分离株对鸡和哺乳动物致病性和传播特性研究。本研究为禽流感防控策略制定提供了参考依据。1 2014-2021年华东地区H3亚型禽流感病毒遗传演化分析对本实验室2014年至2021年间华东地区活禽交易市场共采集的27630份样品进行统计,共分离H3亚型AIVs29株,总分离率为0.1%,鸡源样品19730份,分离出6株H3亚型AIVs,分离率为0.03%,鹅源样品2800份,分离到4株H3亚型AIVs,分离率为0.14%,鸽源样品1750份,没有分离到H3亚型AIV,鸭源样品共3350份,分离到H3亚型AIVs阳性样品19份,分离率为0.57%。根据分离地域、宿主、时间的不同从上述样品中选取H3亚型AIV,并与1株天鹅病料中分离的H3亚型AIV一起进行空斑分离纯化鉴定。在MDCK细胞上经空斑纯化三轮后共成功分离出7株H3亚型AIVs,包括5株H3N2、1株H3N3、1株H3N6亚型AIVs,宿主包括天鹅、鸭和鸡,其中除天鹅源的1株H3N2来自于病料,其余均来自于活禽交易市场。对7株H3亚型AIVs进行全基因组测序并进行关键位点分析和遗传进化分析。分析发现,7株病毒HA蛋白的裂解模式均为340PEKQTR↓GLF348,只有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的特征,且第226位与228位分别为Q和G,更倾向于与禽类唾液酸受体结合。分离株存在 HA 的 T160A 突变,PB2 的 I333T 突变,PB1 的 H436Y 突变,PA 的 A100V、R356K、N409S突变,NP的M105V突变,M的N209D突变,这些突变可能会增加对动物的致病性或者提高病毒的聚合酶活性。7株毒包括PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS所有八个片段都归属于欧亚分支,其中W23910株的HA片段与犬源的一株病毒同源性最高（97.2%）,J84610株的NA和M片段与水貂来源的毒同源性最高（99.7%和99.6%）,说明这两株毒可能发生过跨物种传播。不仅如此,H3亚型AIVs的各个片段还频繁与H1、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11等多种亚型发生重组。2 H3亚型禽流感病毒的生物学特性及致病性评价测定7株H3亚型AIVs的HA、平均致死时间（Mean death time,MDT）、半数组织感染量（Median tissue culture infective dose,TCID50）、半数鸡胚致死量（50%Embryo infective dose,EID50）、生长曲线和受体结合特性等生物学特性以及对鸡、小鼠和豚鼠的致病性。7株病毒HA效价在7-9 log2,96 h内均不会造成鸡胚死亡,EID50在106.35-107.78 EID50/mL之间。病毒在CEF细胞上复制良好,TCID50在104.39-106.72 TCID50/mL之间。7株毒株中,除JY020416株外,其它毒株均在A549上复制不良,最高峰TCID50滴度都不超过104 TCID50/mL。除J84610株外,其它6株病毒在MDCK上和CEF上复制较好,其中2021年的两株分离株4D1-1和LY株在CEF和MDCK上复制最高峰均高于其它株。鹅红细胞和固相ELISA试验结果显示,7株H3分离株中,J84610株仅具有禽类α-2,3唾液酸（Sialic acid,SA）受体结合特性,其余6株同时具有α-2,3和α-2,6-SA受体结合特性。SPF鸡致病性试验结果显示,各毒株感染3天后,4D1-1株仅在肺中检出,W7-4和LY株仅在气管检出,901084株可在气管和回肠检出,W23910株仅在回肠中检出,其余毒株在上述脏器中未检出。小鼠致病性试验结果显示,各毒株均未造成小鼠死亡,但其中JY020416、4D1-1和LY株会造成小鼠体重下降6%以上,4D1-1株最高下降10.5%,体重下降主要集中在前3天,随后逐渐回升。在第3天和第5天,W7-4、JY020416、4D1-1、LY株在小鼠肺脏和鼻腔中均能检出,此外,W7-4、JY020416株也能在小鼠脑中检测到少量复制。W23910株仅在第5天小鼠肺脏中检出,J84610和901084株在鼻腔、肺脏、回肠、脑中均未检出。LY株豚鼠致病性试验结果显示,LY株仅能在豚鼠的鼻腔中复制。以上结果表明,上述H3亚型AIVs虽然仅在鸡的部分脏器中低剂量复制,但有5株可在小鼠肺中复制。3 H3亚型禽流感病毒的传播特性评价本研究进行了鸡之间接触传播和鸡与豚鼠间跨物种接触传播特性评价。7株H3亚型AIVs以106 EID50/100 μL滴鼻攻毒21日龄无母源抗体的3只SPF鸡,攻毒后1天同笼放入3只未攻毒鸡和豚鼠作为接触组,在1、3、5、7、9、11天采集攻毒组鸡的咽拭子和泄殖腔拭子,在2、4、6、8、10天采集接触组鸡的咽拭子和泄殖腔拭子以及豚鼠的鼻洗液,检测排毒情况及21天血清转化情况。在试验中发现,W7-4、JY020416、W23910、901084、LY共5个攻毒组出现了鸡之间的接触传播。除JY020416株外,其它6个攻毒株组均可发生鸡到豚鼠的接触传播。在第21天,所有攻毒组鸡均发了血清阳性转化,HI效价在4-8 log2之间,在接触组鸡中,除J84610组外其它6组均出现血清转阳,但HI效价均低于攻毒组鸡只。在接触组豚鼠中,除JY020416和4D1-1组外,其它5组,包括W7-4、J84610、W23910、901084、LY,发生了血清阳性转化。选用LY株进一步开展豚鼠间接触传播和气溶胶（Aerosal）传播试验,结果显示,攻毒组、直接接触组、气溶胶传播组中各豚鼠均能检测到排毒,并且血清在第14天和21天均检测为阳性。以上结果表明,上述H3亚型AIVs在鸡之间易发生接触传播,并具有跨种接触传播至豚鼠的能力,而且LY株已具有豚鼠间接触传播和气溶胶传播能力。