论文部分内容阅读
背景:蜱虫是一种仅次于蚊子的第二大媒介生物,放牧草食家畜的染蜱率可达100%,极易造成蜱传病的侵染（如梨形虫病等）,严重阻碍了区域性经济和畜牧养殖的健康发展。亚洲璃眼蜱（H.as）和小亚璃眼蜱（H.an）是广泛分布于欧亚大陆和北非的硬蜱种,具有重要的医学和兽医学意义,除了叮咬吸血造成皮肤损伤、炎症等直接致病作用外,也是牲畜重要疾病和某些人畜共患病的媒介。随着杀虫剂耐药性日益增加,通过接种疫苗控制蜱虫被视为一种可持续的替代方法,这也是学术界关注的焦点。抗蜱疫苗候选抗原——组织蛋白酶L（Cathepsin L,CPL）是一种高效的血红蛋白酶,在从宿主获得血液的消化过程中起着重要作用;干扰素-γ（IFN-γ）是一种免疫调节因子,在适应性免疫中起到重要作用。目的:为了综合防控媒介蜱虫,本文首次以IFN-γ分子作为抗蜱疫苗佐剂进行H.as CPL（Has CPL）免疫,评价抗H.as和H.an的保护效果,拟达到预防媒介蜱虫的目的。主要研究方法与结果如下:（1）亚洲璃眼蜱和小亚璃眼蜱的生物学特性研究从新疆奇台和吐鲁番等2个流行地区分别采集了317和291只硬蜱,分别进行形态学和分子生物学鉴定,及不同发育阶段的生物学特性研究。结果显示,蜱虫种属鉴定为H.as和H.an,两者的亲缘关系（同源性>99.00%）与哈萨克斯坦、甘肃等株极为接近;形态对比发现,卵、幼蜱和若蜱间差异不明显,成蜱间呈现肛侧/下板和气门板特征差异;周期对比发现,卵期H.as出现“卵斑”（后期发育成肛门）的时间（19 d）晚于H.an（14 d）,H.as的产卵和卵孵化周期（27.5 d和31.5 d）长于H.an（12.0 d和20.5 d）,H.as饱血若蜱蜕皮和成蜱吸血时间（19.0 d和8.5 d）小于H.an（30.0 d和13.0 d）,H.as和H.an完成一个生活史平均需要131.5和112.5天。（2）亚洲璃眼蜱Has CPL基因的克隆表达及鉴定利用原核表达系统构建了Has CPL/p ET-28a重组质粒并高效表达纯化出His标签融合Has CPL重组蛋白（约18.07 k Da,0.9-1.3 mg/m L）,通过Western blot验证其能被相应阳性血清特异性识别,表现出良好的反应原性;利用真核表达系统构建了Has CPL/p EGFP-C3重组质粒,经转染至BHK-21细胞,通过IFAT验证真核细胞表达的Has CPL能与阳性血清反应产生特异荧光信号,表现出良好的免疫原性。（3）BALB/c小鼠IFN-γ基因的克隆表达及鉴定利用原核表达系统构建了BALB/c小鼠IFN-γ（Mus-IFN-γ）基因的重组质粒（Mus-IFN-γ/p ET-28a）,表达纯化出His标签融合Mus-IFN-γ重组蛋白（约18.51 k Da,0.5-0.8 mg/m L）,经Western blot分析显示其印迹与Mus-IFN-γ蛋白大小位置一致,通过生物信息学方法和IFN-γ-ELISA试剂盒检测确定为IFN-γ蛋白,为后续保护性免疫试验提供了材料。（4）重组Has CPL免疫效应及其抗亚洲璃眼蜱的效果评价将6只新西兰大白兔分成两组,第一组免疫纯化的重组Has CPL,对照组免疫PBS,经过3次免疫后,分别感染H.as成蜱和幼蜱,根据兔血清中抗体、细胞因子水平及蜱虫的饱血率、饱血重量和蜕皮率等指标分析抗蜱效果。结果显示,重组Has CPL免疫后可同时诱导机体产生体液免疫（抗体效价:102 400-409 600）和细胞免疫（细胞因子:IL-4↑、IL-10↑和IFN-γ↑）反应;免疫组产生的特异性抗Has CPL的血清与H.as蜱组织（中肠;唾液腺;卵巢）中天然CPL蛋白发生反应;免疫组雌蜱充血重量（429±21.44 mg）明显低于对照组（789.86±38.28 mg）（P<0.05）;免疫组幼蜱饱血率和蜕皮率（44.40%和39.01%）均分别显著低于对照组（70.13%和54.99%）（P<0.05）;对于抗H.as总体保护效果分析,免疫Has CPL对H.as雌蜱和幼蜱分别产生54.05%和55.09%抑制作用。（5）重组Has CPL诱导交叉保护性免疫抗小亚璃眼蜱的效果评价分别对H.as和H.an两个CPL蛋白（Has CPL,Han CPL）的同源性、B细胞表位、抗原性、疏水性、等电点和温度系数等进行预测比对,然后采用Dot blot、ELISA和免疫组化（IHC）等方法进行验证,最后根据（4）中免疫方法进行交叉保护性实验。结果显示,2个CPL蛋白结构相似、同源性较高（达90.48%）;抗Has CPL血清可与H.as和H.an部分发育阶段蜱的天然CPL蛋白交叉反应;免疫组（Has CPL）饱血成蜱数量和产卵重量显著低于对照组（PBS）,抑制率分别达到21.43%（P<0.05）和38.84%（P<0.001）,对H.an侵染的交叉抑制率达到54.76%。（6）基于IFN-γ分子佐剂免疫重组Has CPL的抗蜱效果评价将实验BALB/c小鼠分为3组,第一组使用Has CPL联合IFN-γ分子共同免疫BALB/c小鼠（CPL+IFN-γ）,其他两组小鼠单独注射Has CPL（CPL）或PBS;经皮下和腹腔等2种途径免疫后,接种H.as和H.an的幼蜱,根据饱血率、蜕皮率等参数分析抗蜱效果。结果显示,联合IFN-γ分子佐剂可显著增强特异性抗体Ig G（Ig G1>Ig G2a）（P<0.001）和细胞因子（IFN-γ和IL-4,P<0.001）的产生;经流式细胞术检测,与PBS组（27.40%;6.24%）相比,用CPL+IFN-γ免疫的雌性BALB/c小鼠脾脏中CD4+T细胞水平（35.19%）显著高于CPL组（30.87%）（P<0.05）;CPL+IFN-γ组幼蜱的饱血率和蜕皮率显著低于CPL组和PBS组,且腹腔免疫效果要优于皮下免疫;皮下免疫试验显示CPL+IFN-γ组产生的抗H.as幼蜱的效果（85.11%）明显高于CPL组（63.28%）;腹腔免疫试验显示CPL+IFN-γ组产生的抗H.as和H.an幼蜱的效果（96.20%,83.41%）明显高于CPL组（62.46%,61.33%）。结论:建立了H.as和H.an实验室纯蜱饲养技术,掌握了这2种蜱虫之间生活史不同阶段的生物学特性和形态学特征的差异:“卵斑”出现时间、肛侧/下板和气门板;克隆高效表达了亚洲璃眼蜱Has CPL和BALB/c小鼠IFN-γ蛋白;Has CPL是一种潜在的交叉抗蜱候选抗原,免疫Has CPL可同时抗H.as和H.an蜱虫;Has CPL联合IFN-γ共同免疫BALB/c小鼠不仅增强了免疫应答,且增强了抗蜱效果;Has CPL有望作为一种有效的抗蜱亚单位疫苗抗原。