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目的:目前针对肉源检测的国家标准方法以单重的PCR和荧光PCR为主,但受检食品成分不明确,低效的单重检测进行非定向筛查难以满足食品安全检测的需求。本课题以狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔子、鼠、鸭、羊这十一种肉源的线粒体DNA作为检测靶标,利用“公共引物”介导的多重PCR技术,构建检测这11种肉源的低成本、高敏感性的多重PCR体系,并研发相应的肉制品检测试剂盒。方法:1、引物的设计和筛选:引物设计包括公共引物、正向引物、特异性反向引物和反向引物(特异性反向引物的5’端连接公共引物)。通过基因数据库资料的搜寻、比对和分析,确定各检测肉源品种的多态性位点,设计各肉源品种的正向引物和特异性反向引物,要求所设计和筛选的引物的Tm、扩增效率须尽量保持一致。公共引物设计原则要求公共引物与11肉源的线粒体DNA为模板扩增无特异性扩增产物。2、构建质粒模板,筛选高敏感性公共引物:将经特异性筛选出的公共引物与肉源16S rRNA基因部分序列的两端进行衔接,然后将其插入质粒载体中,经过测序鉴定后,将阳性质粒的DNA进行不同程度的稀释作为模板,检测各公共引物的敏感性,筛选出高敏感性公共引物。3、多重PCR体系的构建:在所有特异性反向引物5’端与公共引物衔接组成反向引物,正向引物及带有公共引物的反向引物互相进行比对、筛选,再通过PCR实验,验证11种不同肉源品种引物和多重PCR体系的特异性、敏感性和扩增效率。多重PCR反应体系采用降落PCR,先用高退火温度71℃进行10个循环,再用低退火温度60℃进行25个循环。应用优化后的多重PCR体系对市场销售的肉源食品进行检测,验证多重PCR检测技术的可应用性,检测阳性结果通过测序确认检测结果的准确性。4、扩增产物的检测:PCR产物经过凝胶电泳来分析和确认实验结果。结果:建立了用于肉源检测的筛选公共引物的技术,包括公共引物特异性鉴定,重组质粒的构建和公共引物敏感性的检测,筛选出3条“公共引物”,选用其中敏感性最佳的一条公共引物(敏感性为100个拷贝)用于构建多重检测体系。构建了针对鼠、狐狸、鸭和羊肉的“公共引物”介导的4重PCR体系,检测灵敏度甚至可以达到0.05 ng/μL,该检测体系可应用于市场销售的肉制品中羊肉掺假鉴定。通过降低多重引物浓度(多重反向引物浓度可降低至0.00132 gM),有效对该检测技术的检测通量进行提升,成功构建了针对狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸和兔肉鉴定的8重检测体系,该检测体系的敏感性可至0.05ng/μL,可用于市场销售商业肉制品的真假肉鉴定。结论:“公共引物”介导的多重PCR技术可用于肉源鉴定,构建的“公共引物”介导的4重和8重PCR体系,对肉制品中11种动物源性成分的鉴别快速高效。该技术操作简单、低成本并且快捷有效,其特异性和敏感度可用于混合肉制品肉源的鉴定检测。