论文部分内容阅读
目的:研究绞股蓝总苷(GPs)抗动脉粥样硬化病变形成的可能机制,为拓展绞股蓝总苷片的临床应用提供实验依据,为GPs的进一步研发打下基础。
方法：第一部分:采用高脂饲料喂饲和腹腔注射维生素D3方法建立大鼠As模型;60只♂健康SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、绞股蓝总苷(GPs)三个剂量组、辛伐他汀组,按建模及药物干预方法处理7周后处死大鼠,光镜下观察胸主动脉病理学改变;免疫组织化学染色法检测主动脉壁细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和核因子κBp65(NF-κBp65)的表达;ELISA法测定血清氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)水平;比色法测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、硫代巴比妥酸法测定血清丙二醛(MDA)水平。第二部分:体外培养hVECs-12细胞,设置:正常对照组、溶媒组(无水乙醇组)、溶媒组(二甲基亚砜)、50mg/L胆固醇处理48h组、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)组:NAC(10mM)预作用1h后再加入50mg/L胆固醇作用48h、三种浓度GPs(1、10、100μg/mL)作用组:按剂量在培养基中加入GPs预处理1h后再加入50mg/L的胆固醇处理48h。分别用比色法、硝酸酶还原法及ELISA检测细胞培液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、一氧化氮(NO)浓度、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)浓度;免疫细胞化学染色方法检测细胞内核因子-κB p65(NF-κBp65)核移位阳性细胞数;以DCFH-DA为荧光探针,流式细胞术检测细胞内活性氧水平;观察加入产生ROS的4种酶抑制剂后细胞内ROS变化。第三部分:体外培养hVECs-12细胞,设置:正常对照组、GPs对照组:100μg/mLGPs处理48h组、胆固醇组:50mg/L胆固醇处理48h组、GPs作用组:在培养基中加入100μg/mL GPs预处理1h后再加入.50mg/L的胆固醇处理48h。化学比色法检测细胞培液中一氧化氮合酶(NOS)、黄嘌呤氧化酶(XOD)活性及细胞内NADPH氧化酶(NOX)活性;Real-time PCR检测hVECs-12内NOX4 mRNA转录水平、Western blot检测NOX4蛋白表达水平。
结果：1.高脂饲料加大剂量维生素D3注射液造模7周可使大鼠主动脉形成较典型的的As斑块,成功建立了大鼠As模型。2.与模型组比较显示GPs可减轻As病变,下调主动脉壁ICAM-1、MCP-1和NF-κBp65的表达(P＜0.01),降低血清MDA、ox-LDL水平(P＜0.01),升高血清T-AOC水平(P＜0.01)。3.成功培养了人脐静脉血管内皮细胞株(hVECs-12),抗vWF因子单克隆抗体免疫荧光结果鉴定为内皮细胞。4.胆固醇能升高hVECs中ROS水平(P＜0.01),激活细胞内NF-κBp65的核移位(P＜0.01),并能升高细胞培养液中LDH活性、MCP-1浓度、降低NO浓度(P＜0.01)。5.与胆固醇作用组比较,抗氧化剂NAC能降低hVECs中ROS的水平(P＜0.01),并能降低培液中LDH活性、MCP-1蛋白量、升高NO浓度(P＜0.01)。6.NOX抑制剂DPI能显著降低细胞内ROS水平(P＜0.01),Retenone也可以部分抑制ROS的产生(P＜0.05),而其他酶抑制剂几乎不影响胆固醇所诱导的ROS升高(P＞0.05)。7.与胆固醇损伤组比较,GPs可减少细胞培液中LDH活性,MCP-1浓度,增加NO浓度(P＜0.01),同时降低细胞内ROS的水平(P＜0.01),抑制NF-κB p65的核移位(P＜0.01)。8.与胆固醇作用组比较,GPs可升高细胞培液中NOS的活性,降低细胞内Nox活性(P＜0.01),同时下调NOX4 mRNA转录和蛋白表达水平(P＜0.05),但对细胞培养液中XOD的活性几乎没有影响(P＞0.05)。
结论：1.在高脂诱导的As大鼠模型上观察到,GPs能通过下调致As病变形成的关键性炎性分子ICAM-1,MCP-1表达,抑制As病变。其下调两分子的机理与GPs能增强机体抗氧化能力,进而抑制调控ICAM-1,MCP-1表达的核转录因子NF-κB激活有关。2.一定浓度的游离胆固醇能引起人内皮细胞中ROS升高,激活NF-κB,导致细胞损伤,此产生的ROS主要来源于NOX。3.GPs对胆固醇所致的hUVECs损伤具有保护作用,这是它能抑制As病变形成的又一机制。保护效应与GPs能降低细胞内ROS水平,抑制NF-κB激活有关。4.GPs能降低hUVECs中NOX活性,抑制NOX4m RNA和蛋白表达,这是它抗氧化作用的重要机理。