促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是动物体内重要生殖激素之一,其主要作用是调控动物生殖过程。GnRH由丘脑下部的GnRH神经元合成,以脉冲方式释放,通过垂体门脉循环进入垂体前叶,与垂体上的GnRH受体结合,调节促黄体激素(Luteinizing hormone, LH)和促卵泡激素(Follicle stimulating hormone, FSH)的合成和分泌,继而通过血液循环调节性腺类固醇激素的产生和雌雄配子的发生。GnRH主动免疫动物能降低动物体内FSH、LH含量,使性腺退化、萎缩甚至停止发育,影响其生殖功能从而达到去势的目的。利用GnRH主动免疫可以避免外科手术或药物去势对动物造成的应激、感染、药物残留等问题,并且不影响动物生产性能,也更符合动物福利的要求,是一种有望替代传统外科手术给动物去势的新方法。KiSS-1基因是KiSS基因的亚型,主要在中枢神经系统和胎盘表达,该基因编码的一组肽产物称为kisspeptins, GPR54(G protein-coupled receptor54)是kisspeptin的天然受体。KiSS-1/GPR54系统与生殖系统的发育有密切关系：研究表明,GnRH神经元是kisspeptins的直接调节对象；目前普遍认为的作用机制是kisspeptins与GPR54结合,激活GnRH神经元,刺激GnRH的释放,进而调节FSH和LH的释放。GnRH主动免疫动物能使其达到去势效果,但去势机制是怎样的?去势效果维持时间的长短在不同研究中为何有较大差别?关于这些问题目前尚无统一定论。鉴于此,本研究制备了GnRH免疫去势疫苗,主动免疫SD大鼠,结合大鼠血清抗体、血清激素、生殖相关基因及其受体mRNA表达变化情况,探讨主动免疫后KiSS-1/GPR54系统和下丘脑-垂体-性腺轴各级激素、受体和配体的调控关系,以期阐明GnRH主动免疫去势的作用机理；此外,还对GnRH免疫去势的可逆性进行了研究。本文开展的主要研究工作和取得的结果如下：1.以组成GnRH的9种氨基酸为原料合成GnRH并列体(GnRH-Tandem)和GnRH并列体二聚物(GnRH-Tandem-Dimer, GnRH-TD),使用碳二亚胺法将GnRH-TD与卵清蛋白(OVA)偶联,制成GnRH-TDO免疫原,经SDS-PAGE分析,在51.5KDa处出现了预期条带,得到合格的免疫原；以矿物油、‘Tween-85和span-85为原料制作specol佐剂,将GnRH-TDO免疫原与specol佐剂充分乳化制成GnRH-TDO去势疫苗,检验去势疫苗的物理特性和稳定性,均符合要求。制得合格的GnRH-TDO免疫去势疫苗。2.选取健康性成熟雄性SD大鼠72只,随机分为GnRH免疫去势组(mIG)、手术,去势组(mSG)和空白组(mCG),每组24只(各组再随机分为3个小组,n=8)。mIG于12周龄腿部肌肉注射1mL疫苗(含GnRH-TD50μg),4周后加免,加免时注射剂量及方法同初次免疫；mSG于11周龄进行手术,摘除睾丸；mCG不做任何处理。初次免疫当天记为Owpv (weeks post vaccination)。初免当天起每2周空腹尾尖采血1次,直至处死。所有血样分离血清,使用ELISA法测定血清抗体含量,RIA法测定血清激素T、FSH和LH含量。各小组雄鼠分别于8wpv、12wpv、16wpv处死,分离下丘脑、垂体,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因]mRNA表达情况；mIG和mCG分离双侧睾丸,去除附睾后精确称重,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因]nRNA表达情况。GnRH主动免疫雄鼠后,血清抗体滴度升高,睾丸重量减小,睾丸严重皱缩。在8wpv、12wpv和16wpv采样时,mIG睾丸平均重量分别为mCG睾丸平均重量的55.22%、54.31%和42.55%,均显著低于mCG (p＜0.05)。GnRH主动免疫使mIG大鼠血清T、FSH和LH浓度显著下降,均显著低于mCG(p<0.05)。而外科手术去势使血清T含量显著下降至检测限附近,而使血清FSH和LH含量上升,二者浓度均显著高于空白组(p<0.05)。与mCG相比,GnRH主动免疫显著下调下丘脑GnRH, GPR54、KiSS-1和AR mRNA,垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及睾丸FSHR、LHR和AR mRNA表达水平(p<0.05)；而外科手术显著下调下丘脑下丘脑GnRH、GPR54、KiSS-1和AR mRNA、睾丸FSHR、LHR和AR mRNA表达水平(p<0.05)的同时,对垂体GnRH-R、 FSH-β和LH-βmRNA表达水平显著上调(p<0.05)。3.选取健康性成熟雌性SD大鼠72只,随机分为GnRH免疫去势组(fIG)、手术去势组(fSG)和空白组(fCG),每组24只(各组再随机分为3个小组,n=8)。fIG于12周龄腿部肌肉注射1mL疫苗(含GnRH-TD50μg),4周后加免,加免时注射剂量及方法同初次免疫；fSG于11周龄进行手术,摘除卵巢；fCG不做任何处理。初次免疫当天记为0wpv。初免当天起每2周空腹尾尖采血1次,直至处死。所有血样分离血清,使用ELISA法测定血清抗体含量,RIA法测定血清激素E2、P4、FSH和LH含量。各小组雌鼠分别于8wpv、12wpv、16wpv处死,分离下丘脑、垂体,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因mRNA表达情况；fIG和fCG分离双侧卵巢,去除脂肪组织后精确称重,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因mRNA表达情况。GnRH主动免疫雌鼠后,血清抗体滴度升高,卵巢重量减小,卵巢和子宫萎缩。8wpv、12wpv和16wpv采样时fIG卵巢平均重量分别为fCG平均重量的63.63%、38.46%和21.43%,均显著低于fCG (p＜0.05)。GnRH主动免疫使fIG大鼠血清E2、P4、FSH和LH浓度显著下降,均显著低于fCG (p＜0.05)。而外科手术去势使fSG大鼠血清E2、P4含量显著下降至检测限附近；而使其血清FSH和LH含量上升,二者浓度均显著高于空白组(p＜0.05)。GnRH主动免疫明显下调雌鼠下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-α mRNA、垂体GnRH-R、FSH-β和LH-β mRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-α mRNA的表达水平(p<0.05)。而外科去势对雌鼠生殖相关基因]mRNA的表达调控有不同影响：显著下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-α mRNA,以及卵巢FSHR、LHR和ER-α mRNA的表达水平；与此同时,显著上调垂体GnRH-R、FSH-β和LH-β mRNA表达水平。4.选取健康性成熟雄性SD大鼠24只,随机分为免疫组(mIG)、手术组(mSG)和空白组(mCG),每组8只(n=8)。mIG于12周龄腿部肌肉注射1mL疫苗(含GnRH-TD50μg),4周后加免,加免时注射剂量及方法同初次免疫；mSG于11周龄手术摘除睾丸；mCG不做任何处理。初次免疫当天记为0wpv。初免当天至8wpv每2周、8wpv至56wpv每4周空腹尾尖采血1次,直至处死(56wpv)。所有血样分离血清,使用ELISA法测定血清抗体含量,使用RIA法测定血清激素T、FSH和LH含量。各组大鼠于56wpv处死,迅速分离下丘脑、垂体,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因mRNA表达情况；mIG和mCG分离双侧睾丸,精确称重,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因mRNA表达情况。GnRH主动免疫雄性大鼠,产生抗GnRH抗体,在12wpv时达到高峰并维持较长时间,20wpv后开始下降,至40wpv时抗体滴度下降至免疫前水平,至56wpv处死时几乎已无抗体存在。56wpv采样时,大鼠睾丸表面仍然皱缩,轻按可以感觉到并无弹性,且重量显著低于mCG (p＜0.05);主动免疫显著降低mIG大鼠血清T、FSH和LH含量,至56wpv处死时除T含量有微弱上升,FSH和LH含量维持较低水平。三种激素含量显著低于mCG (p＜0.05)。外科手术去势使mSG大鼠血清T含量显著下降至检测限附近；而使其血清FSH和LH含量上升,二者浓度均显著高于空白组(p<0.05)。GnRH主动免疫56wpv后,下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和AR mRNA,垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及睾丸FSHR、LHR和AR mRNA的表达水平均显著低于mCG(p<0.05)；对于mSG,56wpv采样时,雄鼠下丘脑GPR54、KiSS-1、 GnRH和AR mRNA,以及睾丸FSHR、LHR和AR mRNA的表达水平均显著低于mCG,(p<0.05),而垂体GnRH-R, FSH-β和LH-β mRNA表达量显著高于mCG(p＜0.05)。5.选取健康性成熟雌性SD大鼠24只,随机分为免疫组(fIG)、手术组(fSG)和空白组(fCG),每组8只(n=8),fIG于12周龄腿部肌肉注射1mL疫苗(含GnRH-TD50μg),4周后加免,加免注射剂量及方法同初次免疫；fSG于11周龄进行手术,摘除卵巢；fCG不做任何处理。初次免疫当天记为0wpv。初免当天至8wpv每2周、8wpv至56wpv每4周空腹尾尖采血1次,直至处死。所有血样分离血清,使用ELISA法测定血清抗体含量,RIA法测定血清激素E2、P4、FSH和LH含量。各组大鼠于56wpv处死,分离下丘脑、垂体,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因mRNA表达情况；fIG和fCG分离双侧卵巢,去除脂肪组织后精确称重,提取总RNA,使用荧光定量PCR测定各基因mRNA表达情况。GnRH主动免疫雌性大鼠，产生抗GnRH抗体,在12wpv时达到高峰并维持较长时间,20wpv后开始缓慢下降,40wpv时抗体滴度下降至免疫前水平,至56wpv处死时几乎已无抗体存在。GnRH主动免疫56周后,卵巢和子宫仍然保持较好的去势状态,fIG卵巢重量显著低于fCG (p＜0.05)。主动免疫显著降低fIG大鼠血清E2、P4、FSH和LH含量,至56wpv处死时除E2和LH含量有微弱上升,P4和FSH含量维持较低水平。四种激素含量显著低于mCG (p＜0.05)。而外科手术去势使fSG大鼠血清E2、P4含量显著下降至检测限附近,血清FSH和LH含量上升,二者浓度均显著高于空白组(p<0.05)。GnRH主动免疫56wpv后,雌鼠下丘脑GPR54、KiSS-1、 GnRH和ER-α mRNA,垂体GnRH-R、FSH-β和LH-β mRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-α mRNA的表达水平均显著低于mCG (p＜0.05);对于fSG,56wpv采样时,下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-α mRNA,以及卵巢FSHR、LHR和ER-a mRNA的表达水平均显著低于mCG (p＜0.05),而垂体GnRH-R、FSH-β和LH-β mRNA表达量显著高于mCG。综上所述：GnRH-TDO具有良好的免疫原性。GnRH-TDO主动免疫能显著抑制SD大鼠性腺发育,显著降低血清FSH、LH以及性激素(雄性血清T,雌性血清E2和P4)的含量；GnRH-TDO主动免疫显著下调雄性和雌性SD大鼠下丘脑GnRH、 GPR54、KiSS-1和AR mRNA/ER-a mRNA,垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及性腺FSHR、LHR和AR mRNA/ER-α mRNA表达水平。主动免疫降低血清性激素含量,通过下丘脑AR mRNA/ER-a mRNA-GPR54/KiSS-1通路,下调GnRH mRNA表达,从而降低血清FSH、LH含量,最终使动物去势。经GnRH-TDO主动免疫56w后的SD大鼠仍处于去势状态,雄性大鼠血清T含量和雌性大鼠血清LH含量在试验末期出现上升趋势,揭示GnRH主动免疫造成的动物去势存在恢复的可能,且动物去势状态维持时限可能存在性别差异。