微生物是天然产物的重要来源,随着合成生物学的快速发展和基因组测序技术的进步,越来越多的微生物基因组测序工作已完成,人们在这些微生物基因组发现了大量的微生物次级代谢产物生物合成基因簇尚未被开发和研究,但是很多微生物很难进行遗传操作或者在实验室内无法培养。将基因簇转入遗传背景清晰、易操作的宿主菌进行异源表达是开发生物合成资源的一种重要手段。但是微生物次级代谢产物基因簇一般大于20 kb,很难通过PCR的方式获得。获得基因簇的传统方法是构建基因组文库,但是周期长、操作复杂,不能满足高通量克隆基因簇的要求。符军等于2012年根据RecE和RecT蛋白能高效介导线性DNA分子之间发生同源重组的特性,开发了能够将目的DNA片段从基因组直接捕获至载体上的直接克隆技术。目前RecET直接克隆技术已被广泛应用于次级代谢产物基因簇的异源表达研究。次级代谢产物在异源表达时经常需要对表达载体进行修饰以添加基因转移元件、插入正调控基因、敲除负调控基因等。基于酶切和连接的传统DNA重组方法由于受到酶切位点和DNA分子大小的限制,难以完成这些遗传修饰。张友明等于1998年利用大肠杆菌Redαβ蛋白能够高效介导线性DNA分子和环状DNA分子之间发生同源重组的特性,建立了不受DNA分子大小和限制性酶切位点制约的DNA重组工程技术(Recombineering)。该技术能够精确、高效地对质粒、黏粒和细菌人工染色体等DNA分子进行基因插入、基因敲除、点突变和模块替换等操作,尤其适合天然产物基因簇的遗传改造。本研究将RecET DNA直接克隆系统和Redαβ DNA修饰系统整合到一个大肠杆菌宿主中,并通过克隆载体和DNA转移元件的标准化,建立了生物合成途径高通量直接克隆、修饰和异源表达的技术平台。在该技术平台中,我们针对不同大小基因簇和不同DNA序列特点构建了便于操作的直接克隆载体,同时将接合转移和转座元件、位点特异性重组元件、广宿主多拷贝复制子两侧的序列进行了标准化,使其都能通过Redαβ重组快速插入上述所有克隆载体中,使一个载体可以适用于细菌接合转移,转座和位点特异性重组等不同遗传操作手段,便于快速的进行异源表达研究。该技术平台实现了生物合成途径克隆、转移和异源表达的无缝对接,只需要一周就能完成生物合成途径的克隆及基因转移元件的插入,大大简化了DNA克隆、修饰、转移和异源表达的流程。利用该技术平台,我们对波赛链霉菌ATCC 27952、刺糖多孢菌NRRL18395和阿维链霉菌DSM 46492基因组中的次级代谢产物基因簇进行了克隆和异源表达研究。土壤和海洋宏基因组中的次级代谢产物基因簇由于浓度低而很难通过直接克隆获得,从头合成是克隆宏基因组中基因簇的有效方法,但是该方法对DNA组装效率的要求较高。本研究通过结合寡核苷酸体外退火和RecET介导的线性DNA分子间的同源重组建立了头合成基因簇的方法。该方法的策略是:(1)首先将10个两端带有20 nt互补配对序列的60 nt寡核苷酸组装成420 bp的双链DNA片段;(2)把10个两端带有40 bp同源序列的420 bp片段组装成4020 bp的中等长度DNA片段;(3)把两端带有40 bp同源序列的4020 bp片段组装成最终目的基因簇。我们利用该方法从头合成了在海鞘共生蓝细菌中发现的非核糖体多肽patellamide A的12.7 kb基因簇,并在大肠杆菌中进行了异源表达研究。本论文构建的基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达技术平台为微生物基因组的开发利用提供了便利。