细菌或病毒感染机体诱导中性粒细胞释放过多的中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),导致HNE和其内源性抑制剂的失衡。过多的HNE会导致肺组织毛细血管壁通透性增加,组织液渗漏,进而引发炎症,这是导致肺部炎症性疾病的重要机制之一。课题组前期工作中,建立了体内外HNE活性抑制实验模型,发现中药中的五环三萜类成分具有不同程度的抑制HNE活性,可以降低肺毛细血管的通透性,改善肺损伤状态。在机制研究方面,我们通过酶动力学实验和核磁共振研究发现五环三萜类成分与HNE的可逆性竞争结合模式,可克服化学药西维来司钠的副作用。桔梗甘草汤为《伤寒论》中主治肺部疾病的传统方剂,具有宜肺利咽,清热解毒的功效,主治咽痛喉痹,风热郁肺。现代临床常应用于治疗咳嗽、咽痛、肺痈等肺部疾病。研究表明桔梗和甘草的主要活性物质为皂苷类成分,它们对肺部炎症有较好的抑制效果。桔梗和甘草均含有大量五环三萜成分,桔梗和甘草的抗炎作用和作用机制已有大量的研究,很多文献也报道了五环三萜类物质的抗菌和抗病毒作用。这些研究中尚未见其对抑制HNE活性的报道,故桔梗和甘草中的这些成分的抗炎活性是否与制HNE活性有关尚待研究。基于此,本课题将以桔梗甘草汤为研究对象,以抑制HNE活性为指标开展研究。首先,对桔梗甘草汤及其拆方的抑制HNE活性部位研究发现,乙醇提取组的HNE体外抑制率均显著高于水提组;乙醇提取组中,抑制HNE活性部位集中在石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层,且甘草组和桔梗组的抑制结果与桔梗甘草组没有显著性差异,对三组不同的活性部位进行薄层层析分析,单煎和合煎均未发现存在明显变化的斑点。因此,我们决定对桔梗和甘草分别开展活性部分的化学成分研究。对甘草95%乙醇提取物的乙酸乙酯部位进行HNE活性导向分离,得到18个化合物,其中包括2个脂肪酸类、2个五环三萜类化合物,11个黄酮类化合物和3个其他化合物;对桔梗总苷元进行分离纯化,得到5个五环三萜类化合物。共23个化合物,化合物分别为:亚油酸(1),正十六烷酸(2),3-羟基-9-甲氧基紫檀烷(3),7-羟基-2′,4′-甲氧基异黄烷(4),桦木酸(5),甘草异黄酮C(6),甘草异黄酮(7),1-methoxyphaseollin(8),甘草异黄酮B(9),苯并吡喃异黄酮(10),甘草宁X(11),glyasperin K(12),半甘草异黄酮B(13),新甘草酚(14),glyasperin C(15),3-oxo-18β-glycyrrhetinic acid(16),2′,4",4-三羟基-3-甲氧基查尔酮(17),ulexone A(18),远志酸(19),platycogenic acid A lactone(20),桔梗皂苷元(21),3-O-β-D-glucopyranosyl platicogenic acid A lactone(22),polygalacicacid-3-O-glucoside(23)。经体外抑制HNE实验测试,甘草乙酸乙酯部位中分离得到的18个化合物中,终浓度100μM下,HNE抑制率最高的为亚油酸(1),为93.74%,半数抑制率为12.33μM,此外,3-oxo-18β-glycyrrhetinic acid(16)、ulexone A(18)的抑制率次之,分别为84.45%、81.86%,其他化合物则无显著的抑制HNE活性。在这三个活性化合物中,16为三萜酸类成分,与前期实验结果一致。但活性最好的是亚油酸,出乎我们的预料。经查阅文献发现,有学者对17种游离脂肪酸类化合物进行抑制HNE活性研究,其中15种游离脂肪酸类在500 n M至50μM的终浓度条件下均具有不同程度的HNE抑制性,并且不饱和脂肪酸的抑制活性显著高于饱和脂肪酸。说明我们的结果合理。由此也启发我们亚油酸是否可能是体内内源性的HNE抑制剂之一?该问题有待进一步研究。此外,虽然甘草次酸的抑制HNE活性较好,但由于其在生药中的含量较低,故其可能不是甘草脂溶性部位具有HNE活性的主要物质基础,甘草酸有可能在体内转化为甘草次酸后,发挥了抑制HNE的作用。在对桔梗的抑制HNE活性成分的研究中,我们先富集桔梗总皂苷,再酸水解得到总苷元,体外HNE抑制活性实验表明,总苷元的抑制HNE活性优于总皂苷;对桔梗总苷元进行分离纯化,最后得到5个五环三萜类化合物(化合物19-23),体外HNE抑制活性实验结果发现,5个单体化合物的HNE抑制率均较低,无显著抑制HNE活性。比较桔梗中五环三萜类化合物与前期抑制HNE有效的五环三萜类结构发现,其主要在A、C、E环存在结构差异,推测A环上羟基取代增多可能会降低抑制HNE的活性,而C-11位的羰基结构以及E环羧基的位置,也可能会影响HNE活性。综上研究我们得出初步结论,虽然桔梗甘草汤中存在着较多的五环三萜类成分,但抑制HNE活性可能不是其发挥抗炎作用的主要作用机制。