【摘 要】
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高山被孢霉（Mortierella alpina）是可以生产多种具有生理活性的多不饱和脂肪酸（PUFAs）的产油真菌,其所产脂肪酸主要以三酰甘油（triacylglycerol,TAG）形式存在,相比游离态及乙酯形式,具有较高的稳定性和生物利用率。二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）在生物体中催化脂酰辅酶A（acyl-Co A）与二酰甘油（D
【基金项目】
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科技部国家重点研发计划（2021YFC2100700）；
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高山被孢霉（Mortierella alpina）是可以生产多种具有生理活性的多不饱和脂肪酸（PUFAs）的产油真菌,其所产脂肪酸主要以三酰甘油（triacylglycerol,TAG）形式存在,相比游离态及乙酯形式,具有较高的稳定性和生物利用率。二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）在生物体中催化脂酰辅酶A（acyl-Co A）与二酰甘油（Diacylglycerol,DAG）结合形成TAG,是参与TAG合成的关键酶。DGAT对含有特定脂肪酸的底物的选择性会直接影响TAG中的脂肪酸组成,这对生产含有特定脂肪酸的TAG代谢工程具有重要意义。高山被孢霉中存在多种DGATs,而目前缺乏对这些DGATs的功能特性和底物选择性的比较分析。本文对高山被孢霉中3个DGAT1亚型（Ma DGAT1A/1B/1C）和2个DGAT2亚型（Ma DGAT2A/2B）的序列进行了分析,并将5种Ma DGATs在TAG合成缺陷型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H1246中异源表达,通过测定酵母重组菌在未添加外源PUFAs、外源添加PUFAs及体外微粒体反应中的TAG合成情况,对Ma DGATs的功能特性及底物选择性进行了分析,旨在为提高产油微生物中TAG的产量及生产富含PUFAs的TAG提供一定参考。主要研究内容及结果如下:（1）成功构建酿酒酵母H1246-Ma DGATs重组菌,通过Western blot及相对灰度分析鉴定了蛋白诱导表达的最佳时间并筛选出表达量相对最高的转化子。结果显示:Ma DGAT1A/1B/1C的表达量在诱导时间24 h、48 h、72 h的相对灰度之比分别为:Ma DGAT1A（0.09:0.73:1）,Ma DGAT1B（0.12:0.22:1）,Ma DGAT1C（0.89:0.97:1）,表明最佳诱导时间均为72 h,选择目的蛋白表达量最高的转化子用于后续实验;序列分析表明Ma DGAT1C与Ma DGAT1A/1B在亲疏水性、系统进化方面存在明显差异,结构预测显示Ma DGAT1A/1B相比于Ma DGAT2A/2B具有丰富的螺旋结构,这意味着Ma DGAT1s可能具有比Ma DGAT2s更为复杂的高级结构,从而表现出不同的功能特性。（2）通过薄层色谱（thin-layer chromatography,TLC）及气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析了酵母重组菌所产TAG和总脂质的含量及组成。结果显示:Ma DGAT1A/1B/2A/2B能够恢复酿酒酵母H1246中TAG的合成,表现出DGAT活性,而Ma DGAT1C则未表现出DGAT活性;H1246-Ma DGAT1A/1B/2A/2B的TAG含量（占细胞干重）分别为2.92±0.42%、3.62±0.22%、0.86±0.34%和0.18±0.09%,表明Ma DGAT1A/1B在酵母重组菌中促进TAG合成的效果显著优于Ma DGAT2;在酵母重组菌中,Ma DGAT1A偏好选择MUFAs中的C16:1,Ma DGAT1B偏好选择SFAs中的C16:0,Ma DGAT2A/2B偏好选择SFAs中的C18:0,表明Ma DGAT1A/1B/2A/2B对不同碳链长度及不饱和度的底物的选择性存在一定差异。（3）通过分析外源添加PUFAs条件下酵母重组菌的TAG合成情况以及体外微粒体反应中的TAG产量,较为系统地评估了Ma DGAT1A/1B/2A/2B对PUFAs-Co A和DAG的选择性。结果显示:在酿酒酵母H1246中,外源添加PUFAs条件下,Ma DGAT1A、Ma DGAT2A均偏好将亚油酸（C18:2,LA）组装进TAG,Ma DGAT2B对二十碳五烯酸（C20:5,EPA）以及ω-6 PUFAs中的LA有底物选择性,Ma DGAT1B无明显底物选择性;体外微粒体反应体系中,Ma DGAT1A无明显acyl-Co A选择性,Ma DGAT1B偏好选择C20:5-Co A,而2种DAG中,相比于C20:4/C20:4-DAG,Ma DGAT1A/1B均偏好利用C18:1/C18:1-DAG。综上表明Ma DGATs具有用于生产富含特定PUFAs（LA和EPA）的TAG的潜力。
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