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蕨麻(Potentilla anserina L.),蔷薇科植物鹅绒委陵菜的块根,又名人参果,藏语名戳玛,是一种传统藏药。产于我国东北、华北和西北各地,但只在青藏高原,本种才有块根发育。蕨麻生于河岸、路旁或田野。西藏全境内均有分布,牧区最多,并遍布于青海省海拔3000多米的草原上。蕨麻具有健脾益胃、生津止咳、益气补血、滋阴养肾之功效;主治营养不良、病后贫血、脾虚腹泻、肾虚气亏等病症;而蕨麻所含的化学成分是其治疗功效的基础,因此,加强蕨麻化学成分、药理学的研究,解释蕨麻的治病机理,是现代中药的研究趋势。近几年,国内外对抗氧化剂的研究十分重视,研究表明包括心血管疾病、肿瘤和糖尿病等大部分常见病在内的至少100多种疾病的产生都与自由基有关。因此,以蕨麻为原料,探寻天然无副作用或低副作用的自由基清除剂具有非常重要的意义。
本学位论文以蕨麻的化学成分和抗氧化作用为主要研究内容,探索建立了脂肪酸的高灵敏柱前衍生、高效液相色谱-荧光检测-大气压化学电离质谱鉴定(HPLC-FLD-APCI/MS)分析方法,氨基酸的高灵敏柱前衍生、高效液相色谱-荧光检测-电喷雾电离质谱鉴定(HPLC-FLD-ESI/MS)分析方法和单糖的高灵敏柱前衍生、毛细管区带电泳-紫外检测(CZE-UV)分析法及黄酮类化合物的高效液相色谱-二极管阵列检测-大气压化学电离质谱鉴定(HPLC-DAD-APCI/MS)分析方法,并对蕨麻多酚类物质的抗氧化作用进行了系统研究,取得了以下研究成果和结论。
1、采用柱前衍生HPLC-FLD法分析了不同溶剂萃取得到的蕨麻脂肪酸成分。柱前荧光衍生试剂2-(11H-苯[a]咔唑)-乙基对甲苯磺酸酯(BCETS)能够快速标记脂肪酸,经梯度洗脱实现了32种脂肪酸(23种饱和、9种不饱和脂肪酸)衍生物的完全分离,使用外标法定量,建立了同时测定32种脂肪酸绝对含量的方法。分析对比了混合溶剂萃取(氯仿/甲醇/水=10/5/3)和正己烷萃取的蕨麻脂肪酸种类及含量的差异。结果表明,蕨麻的主要脂肪酸成分为油酸、亚油酸、亚麻酸、二十二碳单烯酸,二十四碳单烯酸等不饱和脂肪酸,占总脂肪酸成分的76％(g/g)以上。
2、以1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)作为柱前衍生试剂,建立了9种单糖的CZE-UV分析方法,通过NMP与传统单糖衍生试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的比较,发现NMP作为衍生试剂具有更高的紫外检测灵敏度。同时,采用气相色谱-质谱(GC-MS)进一步分析鉴定了蕨麻多糖的单糖组成。结果表明,藏药蕨麻多糖的单糖组成以阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)和半乳糖醛酸(GlcUA)含量最高,葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)含量居中,木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)相对其它几种单糖含量较低,与GC-MS分析结果一致。蕨麻多糖的光谱性质研究表明,蕨麻多糖是分子量较小的α吡喃糖,而且有氨基糖的存在
3、以2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑-乙氧基)-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)作为柱前衍生试剂,建立了20种氨基酸的HPIC-FLD-MS分析方法,并验证了DBCEC-Cl比以往报导的氯甲酸芴甲酯(FMOC)、咔唑-9-乙基氯甲酸酯(CEOC)、1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯(BCEOC)及6-氨喹啉基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC)氨基酸衍生试剂相比具有更高的紫外和荧光检测灵敏度。用建立的方法成功分析鉴定了蕨麻中的氨基酸,结果显示,蕨麻含有丰富的氨基酸(18种),其中7种是人体必须的氨基酸,分别是赖氨酸(Lys),亮氨酸(Leu),异亮氨酸(Ile),苏氨酸(Thr),缬氨酸(Val),蛋氨酸(Met),苯丙氨酸(Phe);其中赖氨酸、苏氨酸和色氨酸占有很大的比例。
4、建立了HPLC-DAD-APCI/MS分离测定芦丁、黄芩苷、槲皮素、山奈酚、异鼠李素和木犀草素六种黄酮的方法;结合实验结果,详细介绍了上述六种黄酮类化合物在大气压化学电离源正离子模式下的质谱分析及鉴定方法。方法的灵敏度高、线性范围宽、定性和定量准确。用建立的方法成功测定了蕨麻中黄酮的含量。
5、探讨了蕨麻酚类化合物的体外抗氧化活性,包括总酚酸的测定,清除DPPH自由基实验和FRAP还原实验;同时,利用响应面分析法考察了微波萃取条件对蕨麻酚类物质提取量及对DPPH和FRAP抗氧化能力的影响。结果显示,根据提取条件的不同,蕨麻总酚酸的含量在702.3-1301.5 mg没食子酸/100g干重(DW)之间、对DPPH自由基的清除能力在152.1-203.3 mg没食子酸/100gDW、对FRAP的还原能力在94.9-152.7 mg没食子酸/100g DW之间变化。由响应面分析的回归方程,确定了微波提取蕨麻总酚酸的最佳工艺参数、蕨麻酚类化合物对DPPH自由基清除能力的最佳工艺参数以及对FRAP还原能力的最佳工艺参数。为研制以蕨麻多酚类化合物为主要成分的天然抗氧化剂提供参考依据。