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结合预试验及实验室的前期研究成果,本研究以具有潜在Nrf2抑制活性的药物二甲双胍为基础,通过联合促氧化物质(药物),诱导肿瘤细胞产生大量ROS,挖掘不同的新型联合方案,用于肝癌等肿瘤的化疗治疗中。第一部分:二甲双胍-多柔比星组合药物选择性抑制肝癌细胞增殖及机制目的:研究二甲双胍对化疗药物多柔比星的增效作用,为联合用药方案提供科学依据。方法:体外实验方法,各种药物处理时间均为24h。采用SRB方法检测以上细胞存活率,通过彗星实验检测细胞DNA损伤,Western Blot方法检测细胞DNA损伤修复蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP1)蛋白表达,并通过检测胞内总ATP、NAD+及NADH、总活性氧水平。结果:二甲双胍对L-02(27.53±2.91 m M)、SMMC 7721(25.94±1.76 m M)及Hep G2细胞(21.10±1.08 m M)的半数抑制浓度具有统计学差异(p<0.05);联合多柔比星后,两种肝癌细胞系的存活率随着二甲双胍浓度的增高逐渐下降,其中在二甲双胍浓度为20 m M及40 m M时,其存活率显著低于L-02细胞系(p<0.05),SRB及Brd U ELISA实验均发现在二甲双胍浓度为20 m M时差异最为显著。二甲双胍联合多柔比星组较其他药物处理组,PARP1蛋白表达水平显著提高(p<0.05)、ATP及NAD+/NADH比值水平显著降低;在加入PARP1抑制剂Rucaparib后,联合组ATP及NAD+/NADH比值水平较未加抑制剂时小幅提升;在加入烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂FK-866后,联合组NAD+/NADH比值水平降低,降低幅度较其他组变化最显著(p<0.05),但联合组对肿瘤细胞与正常细胞存活率间的选择性差异缩小;加入烟酰胺单核苷酸后,L-02及Hep G2细胞系胞内NAD+/NADH比值及水平提升,细胞存活率也提升,但联合组细胞存活率在两种细胞系间无统计学差异。结论:二甲双胍联合多柔比星后可以选择性提升肝癌细胞内的活性氧水平、PARP1表达水平、降低NAD+/NADH及ATP水平,使肿瘤细胞代谢-氧化还原过程脱偶联,从而抑制肝癌细胞系增殖,在体外细胞培养体系中,二甲双胍可以增效多柔比星的化疗效果。第二部分:二甲双胍-抗坏血酸组合药物选择性抑制肝癌细胞增殖及机制目的:研究二甲双胍与促氧化及高剂量抗坏血酸联合用药作为新型化疗方案的可能性,探讨发挥药理作用的相关机制。方法:采用体外实验方法,检测不同细胞系在,各种药物处理24h后的存活率。采用SRB法及集落形成实验检测细胞存活率,初步机制的研究立足检测细胞内过氧化氢清除率、过氧化氢生成、过氧化氢酶酶活力、葡萄糖摄取能力,通过双荧光素酶报告基因检测氧化还原元件ARE转录活性,Western Blot方法检测细胞Nrf2蛋白的细胞核与细胞质分布、检测总FOXO3a蛋白表达水平。结果:单用抗坏血酸(20 m M)时,肿瘤细胞存活率显著低于正常细胞系(L-02及16HBE细胞)(p<0.05),联合二甲双胍后,所有检测细胞的存活率均有所下降,随着加入二甲双胍的剂量增大,呈现剂量-反应关系,但正常细胞系的存活率仍高于肿瘤细胞(p<0.05)。二甲双胍联合高剂量抗坏血酸后,能相比L-02细胞更为显著地提升Hep G2细胞内过氧化氢水平(p<0.05),抑制胞内过氧化氢酶酶活力及总巯基含量,同时降低细胞对葡萄糖摄取能力,抑制胞内6-磷酸葡萄糖脱氢酶,Nrf2蛋白在细胞核内表达量下降,细胞磷酸化的FOXO3a蛋白表达下降。结论:二甲双胍联合抗坏血酸一方面可以选择性诱导肿瘤细胞产生更多的过氧化氢,另一方面通过抑制肿瘤细胞内磷酸戊糖代谢途径、下调磷酸化的FOXO3a蛋白、Nrf2蛋白表达,从而抑制细胞内过氧化氢酶活力,导致细胞对过氧化氢清除能力下降,从而抑制肿瘤细胞系增殖,该联合给药方法具有潜在的实际应用价值。